淫羊藿苷对高重力下成骨细胞MC3T3—E1增殖与凋亡的影响

李军+宋光明+孙明林++黃揆++张春秋+付浩++李瑞欣++张西正

[摘要] 目的 体外模拟成骨细胞在体内的生存环境，探讨淫羊藿苷（ICA）对高重力下成骨细胞MC3T3-E1增殖与凋亡的影响。 方法 将成骨细胞随机分为三组：高重力组、高重力+ICA组（以下简称“联合组”）和对照组，其中，高重力组予以20G高重力，联合组将20G高重力和10 μg/L ICA同时应用于细胞，对照组正常培养，不进行任何附加操作。采用MTT法检测细胞增殖，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡，实时定量PCR（qRT-PCR）检测细胞凋亡相关基因，透射电镜（TEM）检测细胞亚细胞结构变化。 结果 MTT法检测显示，高重力组吸光度值显著低于对照组（P < 0.01），联合组吸光度值显著高于对照组和高重力组（P < 0.01）。FCM检测显示，高重力组凋亡率显著高于对照组（P < 0.01），联合组凋亡率显著低于对照组和高重力组（P < 0.01）。qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，高重力组Bax、Bcl2、Bax/Bcl2、P53的mRNA表达均显著上调（P < 0.01或P < 0.05），联合组除Bax/Bcl2 mRNA表达外均显著下调（P < 0.05或P < 0.01），且联合组Bax、Bcl2、Bax/Bcl2、P53的mRNA表达均显著低于高重力组（均P < 0.01）。TEM下可见高重力组呈中晚期凋亡和变性坏死现象，而其他两组无明显变化。 结论 成骨细胞可响应高重力刺激信号并发生一系列变化；高重力（20G）不仅可抑制成骨细胞增殖，促进细胞凋亡，还可导致成骨细胞发生变性坏死，但适当浓度（10 μg/L）的ICA可逆转高重力加载所导致的这种不利影响，对成骨细胞起相应的保护作用。

[关键词] 成骨细胞；淫羊藿苷；高重力；增殖；凋亡

[中图分类号] R681 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0019-05

淫羊蕾又名放杖草、千两金、三枝九叶草等，为小檗科淫羊藿属的多种植物的干燥地上部分。《本草纲目》记载其有“益糟气，坚筋骨，补腰膝，强心力”的功效。现代中药药理学认为淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿的主要有效成分之一，能增加心脑血管血流量、免疫功能及骨代谢[1]。近年来研究发现，ICA可促进成骨细胞增殖，增强成骨活性，促进骨形成[2-3]。钱卫庆等[4]发现浓度为10 μg/L的ICA可显著促进成骨细胞增殖，并增强其成骨能力。本课题组在之前的实验中发现20G的高重力条件可诱导成骨细胞凋亡并出现变性坏死的现象[5]。然而，很少研究集中在ICA与高重力刺激相结合时对成骨细胞增殖与凋亡的影响。因此，本研究旨在探讨ICA联合高重力对成骨细胞增殖与凋亡的影响，为骨相关疾病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

小鼠MC3T3-E1成骨细胞系由协和医科大学基础医学研究所提供。

1.2 主要试剂与仪器

ICA（CAS：489-32-7，上海融禾医药科技发展有限公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司KGA107）；Trizol试剂（Invitogen，美国）；qPCR试剂盒（InvitogenC11733038，美国）；离心式高加速度加载机（天津理工大学）；酶标仪（TECANInfinite 200Pro，瑞士）；Bio-rad实时定量PCR仪（Bio-RadIQ5，美国）；流式细胞仪（Beckman J6HC，美国）；透射电镜（HT7700，日本）。

1.3 方法

采用课题组特殊设计的离心式高加速度加载机，使之能匹配培养瓶一起固定于转子体对应的凹槽内，相对高重力RCF=1.118×10-5×r×V2单位为×g（重力加速度），其中V为转速，单位r/min；r为离心半径，单位cm。37℃、5%CO2孵箱中进行传代培养，取对数生长期（5×106/瓶）的细胞常规消化，使用移液枪接种至培养瓶（培养皿），并采用完全随机化分组方法分为对照组、20G高重力组（以下简称“高重力组”）、10 μg/L ICA和20G高重力联合组（以下简称“聯合组”）。三组同时接种至培养瓶（25 cm2），密度1×106/瓶，培养24 h后开始在相应高重力下加载。实验组于加载机内在相应高重力下加载30 min连续加载3 d，对照组同步置于除G值外相同的环境中。

1.4 观察指标

1.4.1 MTT法检测细胞增殖 取加载结束后培养24 h的各组细胞，每瓶加入2 mL MTT液，37℃避光孵育4 h，弃去液体，各瓶加入2 mL二甲基亚砜振荡10 min，分别吸取200 μL至96孔板，用酶标仪测其490 nm波长下的吸光度值。

1.4.2 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡 取加载结束后培养24 h的各组细胞，用不含EDTA的胰酶消化2000 r/min离心（r = 10 cm）5 min，用1/15 mol/L PBS洗涤2次，2000 r/min离心5 min，重悬细胞计数至5×105，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL Propidiumlodide混匀，室温避光反应15 min；用流式细胞仪在激发波长Ex=488 nm、发射波长Em=530 nm下进行检测。

1.4.3 qPCR检测基因表达 用Primier 5.0软件设计Bax、Bcl2、P53、GAPDH引物（表1）。按说明书提取各组细胞RNA。反应条件如下：先95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40个循环；72℃冷却2 min。应用2-△△CT法计算各基因相对表达量。

表1 相关基因引物序列

1.4.4 透射电镜（TEM）检测细胞凋亡 取加载结束后培养24 h的各组细胞，1/15 mol/L PBS洗涤，1500 r/min离心5 min，4%戊二醛固定2～4 h以上，4℃条件下送河北医科大学电镜室。按透射电镜制片步骤制片，完成后于透射电镜下观察。

1.5 统计学方法

所有数据均采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）来表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测结果

高重力组吸光度显著低于对照组（P < 0.01），联合组细胞高重力加载后吸光度显著高于对照组和高重力组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见图1。

2.2 流式细胞术检测结果

高重力组细胞凋亡率显著高于对照组（P < 0.01），联合组细胞凋亡率显著低于对照组和高重力组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

2.3 实时定量PCR检测结果

与对照组比较，高重力组Bax mRNA表达显著上调（P < 0.01），联合组表达显著下调（P < 0.05），且联合组表达显著低于高重力组（P < 0.01）。与对照组比较，高重力组Bcl2 mRNA表达显著上调（P < 0.05），联合组表达明显下调（P < 0.05），且联合组表达显著低于高重力组（P < 0.01）。与对照组比较，高重力组Bax/Bcl2 mRNA表达显著上调（P < 0.05），联合组略下调，但差异无统计学意义（P > 0.05），但联合组显著低于高重力组（P < 0.01）。与对照组比较，高重力组P53 mRNA表达显著上调（P < 0.01），联合组表达显著下调（P < 0.01），且联合组表达显著低于高重力组（P < 0.01）。见图3。

2.4 透射电镜检测结果

TEM下观察发现，联合组细胞形态基本正常，与对照组比较，未见明显差异（图4A）。高重力组细胞可见部分细胞皱缩、体积缩小、细胞膜表面微绒毛减少甚至消失，部分细胞膜呈球形向胞外膨出；细胞核核固缩，体积减小，电子密度增加，微绒毛、核仁、核孔减少，部分核膜成锐角向外突起，染色质浓缩致密、边集于核膜下；细胞器数量明显减少，呈中晚期凋亡现象（图4B）；并可见部分细胞膜表面突起减少，内质网扩张，线粒体水肿脊膜消失，高尔基体溶解消失，细胞核肿胀，核周系扩张，细胞器数目减少，呈变性坏死现象（图4C）。

3 讨论

成骨细胞是参与骨形成、修复与重建的最重要的功能细胞之一。在骨形成的过程中多种细胞因子、激素和物理因素都可以影响成骨细胞并调节成骨细胞的功能。成骨细胞增殖率的改变可直观地反映成骨细胞的数量变化和骨组织生长重建的状态，只有细胞数量的不断增加才可产生大量的胶原，从而通过钙化基质的形成产生更多骨组织[6-7]。细胞凋亡是由基因严格控制的细胞自主的有序的死亡方式，通过凋亡可有效清除损伤的和衰老无用的细胞，维持细胞死亡和增殖的动态平衡[8-9]。有研究发现，成骨细胞凋亡速度对维持骨组织吸收和修复重建的动态平衡有着重要作用[10]。近年来，有国外学者研究证实，高重力刺激对成骨细胞的增殖、分化有着重要的调控作用[11-12]。ICA在骨形成和发育的调节中发挥着着重要的作用[13-14]。本研究将ICA联合高重力来探索对骨重建的调节。

MTT法和FCM检测结果表明，20G可抑制成骨细胞增殖诱导并激活细胞凋亡，联合组则可明显提高成骨细胞活性，促进成骨细胞增殖，抑制细胞凋亡。既往研究证实，高重力在40～80G时可抑制成骨细胞增殖促进凋亡，而本研究发现高重力20G时就已明显表现出对成骨细胞增殖的抑制效应[15]。联合组成骨细胞增殖活性增高，凋亡率明显下降，与殷晓雪等[16]以人成骨细胞为研究对象探讨ICA对成骨细胞活性及增殖和分化的影响的发现相仿，其结果可能是ICA对成骨细胞活性的促进作用所导致。

目前认为Bcl-2基因家族和P53基因在凋亡的调控中有着至关重要的作用[17]。Bax基因是Bcl-2基因家族的重要成员之一，表达物Bax蛋白存在于胞质中，是促进凋亡所必须的，在接受凋亡信息后被激活，通過末端疏水结构域附着于线粒体膜上，使其通透性增强，使细胞色素C、凋亡诱导因子和凋亡蛋白酶激活因子1释放，激活caspase系统，进而促使细胞凋亡[18]；Bcl-2与各细胞器的膜相结合主要分布于线粒体外膜、核被膜和内质网上，可阻止多种因素引起的细胞凋亡，如生长因子缺失、应激和化学药物治疗等[19]。Bax/Bcl2比值决定细胞凋亡的启动，还可反映细胞凋亡的程度，是细胞凋亡极为关键的调控因素[20-21]。P53基因是大家公认的与细胞凋亡紧密相关的抑癌基因。在生理情况下，细胞内P53维持在很低的水平，但当细胞受到多种不利因素刺激时，P53基因被激活并作为转录因子细胞核内调控一系列下游靶基因的表达，可通过Bax基因或Bcl-2基因相关信号通道诱导其凋亡[22-24]。本研究发现高重力20G对Bax、Bcl-2、P53基因的表达均有明显的促进作用，联合组对Bax、Bcl-2、P53基因表达都有显著的抑制作用；实验各组细胞Bax/Bcl-2的比值与对照组比较发现，高重力组增高有显著性差异，但联合组略降低并无统计学差异。可见，20G条件下成骨细胞凋亡被激活，而联合组成骨细胞凋亡明显被抑制。

TEM形态学检测是目前大家所公认的确定细胞凋亡的金标准。TEM观察表明，20G不仅可诱导成骨细胞凋亡还可导致其变性坏死，这种凋亡与变性坏死并存的现象可能是由于20G已经达到或者已超出成骨细胞所能承受的能力范围。

综上所述，笔者推测：成骨细胞可响应高重力刺激信号并在形态学和增殖水平发生一系列变化；高重力（20G）不仅可抑制成骨细胞增殖，促进细胞凋亡，还可导致成骨细胞发生变性坏死，但适当浓度（10 μg/L）的ICA可逆转高重力加载所导致的这种不利影响，对成骨细胞起相应的保护作用。该研究对了解ICA联合高重力因素对骨重建的作用十分重要，对将ICA作为骨保护药的开发方面有着指导性的作用，意义重大。

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（收稿日期：2016-11-09 本文编辑：张瑜杰）