环丙基修饰的新型氯硝柳胺类衍生物的合成及抗肺纤维化活性

韩英蕾,谭 醉,邹 胜,黄晴菲*,叶庭洪,王启卫*

(1.中国科学院 成都有机化学研究所，四川 成都 610041；2.中国科学院大学，北京 100049；3.四川大学 华西医院 肝脏外科研究室，四川 成都 610041)

成纤维细胞[1]是细胞外基质的重要来源，而细胞外基质的代谢与组织器官的纤维化密切相关。肺纤维化[2-3]是由各种损害引起组织内细胞外基质异常增生和过度沉积的一种病理过程，并最终破坏正常组织结构和功能。肺纤维化以进行性呼吸困难、干咳等为主要症状，是以弥漫性的肺泡炎、肺间质炎症和间质纤维化为组织学特点的一组疾病群；它是导致众多疾病的重要原因，对人体健康危害极大。近年来，氯硝柳胺主要作为一种潜在抗肿瘤作用的药物而备受科研工作者的关注[4-9]。但其在抑制成纤维细胞中报道较少，王峻峰等[10]报道了将氯硝柳胺制成钠盐、铵盐或者铝盐等，并证实了其可抑制肺纤维细胞的增殖，但其生物利用度较低。

Scheme 1

环丙基环在药物研发中有很重要的作用，它的引入对药物的理化性质产生多种影响，包括增加药效[11]、改善药物的解离度(pKa)、提高生物利用度[12]、增加血脑屏障透过率[13]、适应目标蛋白质的结合位点[14]、改善分子的极性[15]和溶解度等作用。

本文以氯硝柳胺为先导化合物，以2-位羟基为修饰位点，通过乙酰基连接环丙基衍生物片段，共设计合成了6个新的氯硝柳胺类衍生物，并对其结构进行1H NMR和HR-MS(ESI)表征。利用化合物8a～8f对小鼠成纤维细胞的体外抗增殖活性进行了考察。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AVANCE 300 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6或CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Finnigan LCQDECA质谱仪。

1,1-环丙基二甲酸二甲酯，98%，上海皓鸿生物医药科技有限公司；氯硝柳胺，98%，上海毕得医药科技有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 1-氨基环丙基甲酸甲酯盐酸盐(1)的合成

将1,1-环丙基二甲酸二甲酯5.00 g(31.62 mmol)溶于无水乙醇(30 mL)，加入1 mol/L氢氧化钾溶液(32 mL)，25 ℃反应12 h。浓缩反应液，向反应液加水(30 mL)，二氯甲烷(2×10 mL)萃取，水相用1 mol/L的盐酸调节pH至3，二氯甲烷(3×10 mL)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得1,1-环丙基二甲酸单甲酯3.64 g，产率80%；1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:11.19(s,1H),3.66(s,3H),1.86～1.45(m,4H)。

氩气的保护下，将1,1-环丙基二甲酸单甲酯3.43 g(23.80 mmol)溶于甲苯(25 mL)中，依次加入三乙胺4.30 mL(30.94 mmol)，叠氮磷酸二苯酯5.64 mL(26.18 mmol)，反应2 h，加入苄醇6.20 mL(30.94 mmol)，回流18 h。反应结束冷却至室温，加水淬灭反应，蒸除溶剂，用乙酸乙酯(15 mL)溶解，依次用质量分数为10%的盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤，收集有机相，经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=10/1，V/V)纯化得白色固体1-(苄氧羰基氨基)环丙烷-1-甲酸甲酯3.69 g，产率62 %。

氢气保护下，将1-(苄氧羰基氨基)环丙烷-1-甲酸甲酯2.40 g(9.63 mmol)溶于甲醇(40 mL)和四氢呋喃(40 mL)的溶液中，加入10% Pd/C(150 mg)，室温搅拌6 h。硅藻土过滤反应液，甲醇洗涤，将滤液和洗涤液合并浓缩，加入2 mol/L盐酸的乙酸乙酯溶液(10 mL)搅拌5 h，重结晶得白色固体978 mg，产率67%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:8.99(s,3H),3.71(s,3H),1.56～1.18(m,4H)。

(2) 1-(叔丁氧基羰基氨基)环丙烷-1-甲酸甲酯(2)的合成

将18.00 g(52.78 mmol)溶于甲醇(40 mL)中，置于冰水浴中，加入三乙胺11.21 g(110.83 mmol)，滴加二碳酸二叔丁酯12.67 g(58.06 mmol)，室温下反应20 h(TLC监测)。将反应液浓缩，加入1 mol/L的盐酸溶液(2 eq.)，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得到白色固体8.96 g，产率79%,m.p.81.7～82.9 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:5.12(s,1H),3.69(s,3H),1.51(d,J=2.7 Hz,2H),1.44(s,9H),1.16(s,2H)。

(3) 1-(叔丁氧基羰基氨基)环丙烷-1-甲酸(3)的合成

0 ℃下，将21.00 g(4.65 mmol)加入到四氢呋喃/水/甲醇(4 mL/2 mL/2 mL)的溶液中，加入氢氧化锂0.56 g(23.22 mmol)，室温下反应12 h(TLC监测)。将反应液旋干，加水4 mL，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH至4，用甲基叔丁基醚(3×10 mL)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得到白色固体925 mg，产率99%，m.p.172.6～173.8 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:5.14(s,2H),1.58(s,2H),1.45(s,9H),1.23(d,J=9.1 Hz,2H);13C NMR(75 MHz,CDCl3)δ:178.96,155.91,80.04,34.19,28.22,18.23。

(4)4d～4f的合成(以4d为例)

冰水浴下，将3100 mg(0.49 mmol)溶解于二氯甲烷(1 mL)中，向其中加入EDCI 191 mg(0.98 mmol)，滴加苄胺99 μL(0.79 mmol),DMAP 73 mg(0.59 mmol)，室温反应16 h。将反应液旋干，乙酸乙酯(6 mL)溶解，分别用1 mol/L的盐酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得到产物。

4d:白色固体,产率79%,135.3～136.1 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.77(s,1H),7.83(s,1H),7.61(d,J=7.0 Hz,1H),7.44～7.17(m,2H),5.75(s,1H),1.71～1.53(m,2H),1.43(s,9H),1.08(d,J=2.5 Hz,2H)。

4e:白色固体,产率87%,167.9～169.8 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.52(s,1H),7.43(d,2H),7.25(d,2H),5.34(s,1H),1.63(q,J=4.7 Hz,2H),1.46(s,9H),1.08(q,J=4.7 Hz,2H)。

4f:灰白色固体,产率86%,140.0～141.2 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.49(s,1H),7.61(s,1H),7.51(dt,J=7.6 Hz,2.1 Hz,1H),7.29～7.17(m,2H),5.38(s,1H),3.05(s,1H),1.63(q,J=4.7 Hz,2H),1.46(s,9H),1.08(q,J=4.7 Hz,2H)。

(5)5d～5f的合成通法

将化合物4(1.47 mmol)溶于二氯甲烷(4 mL)中，加入三氟乙酸(2 mL)，室温反应2 h，向反应瓶中缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，直至没有气泡产生，分液，二氯甲烷(3×5 mL)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得到的产物直接用于下一步反应。

(6)6a,6c～6f的合成通法

冰水浴下，将化合物7(1.47 mmol)溶于二氯甲烷(2 mL)中，加入三乙胺0.21 mL(1.47 mmol)，缓慢滴加溴乙酰溴(1.47 mmol)，搅拌15 min(TLC监测)，加水(6 mL)，用二氯甲烷(3×3 mL)萃取，合并有机相，用饱和食盐水(3 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=2/1，V/V)纯化得化合物。

6a:白色固体，产率68%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:6.66(s,1H),3.83(d,J=2.2 Hz,2H),2.71(tq,J=7.2 Hz,3.8 Hz,1H),0.91～0.67(m,2H),0.55(ddd,J=6.9 Hz,5.3 Hz,3.8 Hz,2H)。

6c:白色固体，产率49%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:6.86(s,1H),3.82(s,2H),3.21(td,J=7.1 Hz,5.7 Hz,2H),1.57～1.38(m,2H),1.39～1.17(m,2H),0.86(t,J=7.3 Hz,3H)。

6d:白色固体，产率52%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.64(s,1H),7.79(d,J=2.0 Hz,1H),7.64～7.56(m,1H),7.46～7.28(m,3H),3.85(s,2H),1.65(q,J=5.0 Hz,2H),1.11(q,J=5.0 Hz,2H).

6e:白色固体，产率52%;1H NMR(300 MHz,Methanol-d4)δ:7.56～7.36(m,2H),7.13～6.97(m,2H),3.90(s,2H),1.57(q,J=4.6 Hz,2H),1.10(q,J=4.6 Hz,2H)。

6f:白色固体，产率69%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:9.51(s,1H),8.87(s,1H),7.70(s,1H),7.65(d,J=8.3 Hz,1H),7.33(t,J=7.9 Hz,1H),7.18(d,J=7.6 Hz,1H),4.17(s,1H),3.92(s,2H),1.41(q,J=4.4 Hz,2H),0.96(q,J=4.4 Hz,2H)。

(7)6b的合成

冰水浴下，将盐酸甲胺600 mg(8.88 mmol)溶解于二氯甲烷(15 mL)中，加入碳酸钾2.45 g(17.76 mmol)，缓慢滴加溴乙酰溴0.78 mL(8.88 mmol)，搅拌至15 ℃反应3 h，向反应液中加入水(30 mL)，二氯甲烷(3×15 mL)萃取，合并有机相，用饱和食盐水(15 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=2/1，V/V)纯化得310 mg无色油状液体，产率23%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:6.56(s,1H),3.89(s,2H),2.87(d,J=4.9 Hz,3H)。

(8)8a～8f的合成通法

将化合物6(0.85 mmol)溶于乙腈(15 mL)中，加入碳酸钾235 mg(1.70 mmol)，氯硝柳胺277 mg(0.85 mmol)，反应3 h(TLC监测)。减压浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=1/2，V/V)纯化得化合物。

8a:白色固体，产率19%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.86(s,1H),8.63(d,J=9.2 Hz,1H),8.43(d,J=2.6 Hz,1H),8.37(s,1H),8.29(dd,J=9.2 Hz,2.6 Hz,1H),7.93(d,J=2.8 Hz,1H),7.66(dd,J=9.0 Hz,2.8 Hz,1H),7.19(d,J=9.0 Hz,1H),4.88(s,2H),2.63(dq,J=7.1 Hz,3.5 Hz,1H),0.61(dd,J=7.1 Hz,2.3 Hz,2H),0.47～0.24(m,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C18H15N3O5Cl2Na{[M+Na]+}446.0286,found 446.0278。

8b:白色固体，产率23%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.88(s,1H),8.66(d,J=9.2 Hz,1H),8.43(d,J=2.6 Hz,1H),8.36～8.16(m,2H),7.95(d,J=2.8 Hz,1H),7.67(dd,J=8.9 Hz,2.8 Hz,1H),7.19(d,J=9.0 Hz,1H),4.94(s,2H),2.61(d,J=4.6 Hz,3H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C16H13N3O5Cl2Na{[M+Na]+}420.0130,found 420.0118。

8c:白色固体，产率34%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:10.27(s,1H),8.89(d,J=9.3 Hz,1H),8.34(d,J=2.6 Hz,1H),8.23(dd,J=9.2 Hz,2.5 Hz,1H),8.15(d,J=2.8 Hz,1H),7.51(dd,J=8.8 Hz,2.8 Hz,1H),6.95(d,J=8.8 Hz,1H),6.39(s,1H),4.80(s,2H),3.34(q,J=6.7 Hz,2H),1.46(q,J=7.5 Hz,2H),1.35～1.19(m,2H),0.88(t,J=7.3 Hz,3H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C19H19N3O5Cl2Na{[M+Na]+}462.0599,found 462.0587。

8d:白色固体，产率16%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.83(s,1H),9.76(s,1H),8.89(s,1H),8.61(d,J=9.1 Hz,1H),8.34(d,J=2.6 Hz,1H),8.28(dd,J=9.1 Hz,2.6 Hz,1H),7.94(d,J=2.9 Hz,2H),7.90(d,J=8.7 Hz,1H),7.64(dd,J=8.9 Hz,2.9 Hz,1H),7.55(t,J=7.9 Hz,1H),7.42(d,J=7.7 Hz,1H),7.35(d,J=9.0 Hz,1H),5.06(s,2H),1.41(d,J=3.4 Hz,2H),0.98(d,J=3.4 Hz,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C26H19N4O6F3Cl2Na{[M+Na]+}633.0531,found 633.0523。

8e:白色固体，产率15%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.83(s,1H),9.49(s,1H),8.86(s,1H),8.61(d,J=9.2 Hz,1H),8.41(d,J=2.7 Hz,1H),8.29(dd,J=9.1 Hz,2.7 Hz,1H),7.94(d,J=2.8 Hz,1H),7.67(dd,J=9.0 Hz,2.8 Hz,1H),7.52(dd,J=8.9 Hz,5.1 Hz,2H),7.31(d,J=9.0 Hz,1H),7.15(t,J=8.8 Hz,2H),5.03(s,2H),1.49～1.24(m,2H),0.93(q,J=4.4 Hz,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C25H19N4O6FCl2Na{[M+Na]+}583.0563,found 583.0546。

8f:白色固体，产率20%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.81(s,1H),9.48(s,1H),8.86(s,1H),8.60(d,J=9.2 Hz,1H),8.36(d,J=2.7 Hz,1H),8.28(dd,J=8.9 Hz,2.7 Hz,1H),7.94(d,J=2.8 Hz,1H),7.73～7.57(m,3H),7.32(dd,J=8.7 Hz,5.8 Hz,2H),7.17(d,J=7.5 Hz,1H),5.04(s,2H),4.17(s,1H),1.39(q,J=4.7 Hz,2H),0.95(q,J=4.7 Hz,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C27H20N4O6Cl2Na{[M+Na]+}589.0658,found 589.0649。

1.3 体外抗纤维活性测试

采取MTT法测试目标化合物8a～8f的体外抗纤维化活性。选取小鼠成纤维细胞(3T3)，以氯硝柳胺为阳性对照。取对数生长期的3T3细胞接种于96孔培养板，每孔1300个细胞，100 μL/孔，置37 ℃,5%CO2培养箱中孵育24 h。设置空白对照组(不含药物的培养基)和阳性药物组(10 μmol/L)，8a～8f化合物浓度为10 μmol/L，设5个复孔，在CO2培养箱(37 ℃,5%CO2)中培养72 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，再继续培养3 h，去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡 5 min使甲臜颗粒溶解，酶标仪测定 492 nm 波长处光吸收值，计算目标化合物8a～8f对成纤维细胞的抑制率。

使用待测化合物8a～8f对小鼠的成纤维细胞的抑制率来评价待测化合物体外抑制强度，氯硝柳胺(Niclosamide)作为阳性对照。8a～8f对3T3细胞的抑制率值见表1。由表可知，对于合成的目标化合物活性评价结果显示，在10 μmol/L的药物浓度下，设计合成的氯硝柳胺衍生物(8a～8f)表现出了一定的抗肺纤维化活性。环丙基修饰的化合物8a表现出最好的活性，其抑制率达到84.25%，较未经修饰的氯硝柳胺(抑制率75.76%)显示出更好的效果。将环丙基替换为甲基(8b)和丁基(8c)，其活性显著降低，抑制率分别为26.90%和18.05%。说明环丙基在提高氯硝柳胺的抗纤维化活性中具有重要作用。这可能是因为环丙基取代基比甲基和丁基具有更好的稳定性，有利于提高分子的代谢稳定性[16-18]。但在环丙基上引入较大的基团时(8d～8f)，其抗肺纤维化活性会有一定降低，可能是位阻较大的原因。

表1 8a～8f 对小鼠成纤维细胞作用72小时的抑制率Table 1 Summary of in vitro inhibitory activities of 8a～8f against 3T3 cells in 72 h

设计合成了6个新的氯硝柳胺类衍生物(8a～8f)，并通过对小鼠成纤维细胞的体外抑制率，初步评价其抗肺纤维化活性。结果显示，获得了一个具有较好活性的环丙基修饰的氯硝柳胺类衍生物，其抑制率高于阳性对照氯硝柳胺。