应用小动物活体激光共聚焦成像系统对大鼠腹壁循经组织组织液分布的初步观察❋

宋晓晶，张维波△，贾术永，王广军，李宏彦，叶丰瑶,2，顾 鑫,2，熊 枫

(1. 中国中医科学院针灸研究所，北京 100700； 2. 北京中医药大学，北京 100029)

今年初，ScientificReport发表了美国一研究团队使用激光共聚焦内窥镜对人体多种组织间质进行观察的研究结果。报道发现，在活体的间质网状结构中存在大量组织液，约为人体体液总量的1/5，这类网状空间结构以及其中填充的组织液在常规形态学处理后消失。在此之前，这一间质形态未被报道[3]。该文章在国内外引起了热议，国外媒体的报道认为此研究发现了人体的一个新器官，而国内一些学者认为这类结构应该是中医的经络。然而，美国团队的研究主要集中在各脏器黏膜、皮肤组织，并未关注中医经络循行部位的组织，但为中医经络研究提供了启示。经络学说是重要的中医基础理论之一，经络行血气是中医理论阐释人体生命活动、疾病发生变化以及针灸等疗法原理的核心，揭示经络的现代科学内涵对中医的发展至关重要。围绕经络的本质，国内外学者进行了大量探索，观察到一些经脉现象，取得了一定成果，初步证实经脉的存在[1-2]。自上世纪60年代以来，国内外一部分学者研究认为，组织间隙、组织液与经络的结构和功能密切相关，其应该是经络实质的一部分。但由于研究技术的限制，目前仍缺乏更多的客观实验证据证实二者在组织结构上的相关性[4-6]。为进一步探讨经络结构与组织间隙、组织液的关系，研究活体沿经络循行路线的组织间质结构及组织液分布特征，本研究团队使用先进的活体激光共聚焦成像系统对大鼠腹壁循经组织进行了初步观察，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠10只，平均年龄5～7周，体质量380～420 g，由中国军事医学科学院动物中心提供(许可证号SCXK-(军)2011-004)。本研究的实验方案已通过中国中医科学院针灸研究所动物伦理委员会审查批准，所有大鼠均按实验动物饲养和使用的国际标准对待。

1.1.2 实验仪器 小动物活体激光共聚焦成像系统(ViewnVivoB30，OptiScan公司，澳大利亚)；57-6F30 经络定位仪(东华仪器厂，中国)；恒冷箱切片机(Thermo Fisher Scientific公司，英国)；研究级正置显微镜(Nikon，日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光染料尾静脉注射 用 2% 的戊巴比妥钠(30 mg/kg) 大鼠腹腔注射进行麻醉，待大鼠充分麻醉后，将其按仰卧位固定在实验台上。将荧光素纳染料(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)用注射用生理盐水配制成10%的溶液，按0.1 ml/kg的剂量进行大鼠尾静脉注射。

1.2.2 循经低电阻点检测 荧光染料注射后，立即沿大鼠腹部剑突横切并剥离腹部皮肤，暴露3×5 cm范围的腹壁，用消毒脱脂棉擦净腹壁组织表面渗出物。使用 57-6F30 经络定位仪(东华仪器厂，中国)检测大鼠腹壁正中线(相当于任脉循行线)，与任脉线平行旁开5 mm、1cm的非经循行线上的电阻抗，用油性标记笔标记出任脉线上的3个低电阻点(A、B、C点)，与任脉线A点平行旁开5 mm的非经线上的高电阻点D点，与任脉线A点平行旁开1 cm的非经线上的高电阻点E点。

1.2.3 活体激光共聚焦成像检测方法和图像分析 将活体激光共聚焦成像系统的扫描深度分别设置为8、20 μm，激光功率设为130μW。在荧光染料注射30 min时，将扫描探头垂直放置在大鼠腹壁表面，观察、采集大鼠腹壁表面任脉循行线上A、B、C共3点，与任脉A点平行旁开5 mm、1 cm的非经循行线D、E点，以及腹壁其他区域组织的激光共聚焦成像图。用激光共聚焦成像系统软件分析成像视野中荧光染料的分布特征和组织微观结构。

1.2.4 活体组织切片观察 用阿尔新蓝(alcian blue，AB)标记腹中线(任脉)上已经观察过的A、B、C点，迅速切取以标记点为中心大小约1×1×0.5 cm的腹壁组织，放置在恒冷箱切片机速冻台速冻，做20 μm的冰冻切片，避光自然风干后封片，在荧光显微镜下观察大鼠任脉循行线上的组织与旁开组织的形态结构。

2 结果

2.1 大鼠腹壁任脉循行线组织的活体激光共聚焦成像特征

图1示，活体小动物激光共聚焦成像系统外观，从主机接出的激光发射器通过光缆连接到激光探头上，探头可插入体腔内进行观察，也可直接在组织表面进行观察。本研究使用探头体表接触的采集方式。在获取的图像中，亮色区反应荧光染料溶液分布或浸染包绕的区域，白色越多越亮代表含有荧光染料的组织液越多，暗色区反映为各种实体组织、细胞结构。

图1 ViewnVivoB30活体小动物激光共聚焦成像系统

图2示，荧光染料注射约30 min后，检测深度为8 μm或20 μm时，大鼠腹壁表面正中线(任脉循行线)上的A点组织中大部分为白亮区域，这些区域是进入组织间隙的荧光染料和组织液混合的成像显示。在大片的白亮区域中分布有排列成层状或散乱分布且粗细不等的暗色线状结构，其为胶原纤维和弹性纤维；显示的暗色不规则类圆形结构为脂肪细胞，其间隙中分布着分支的线管状结构，其中包含大量暗色不规则圆球，在连续观察时沿管腔内移动，这些不规则圆球是红细胞，管线状结构为毛细血管；视野中还出现了一条边界清晰、粗大的暗色线条状组织，为粗的胶原纤维(图2 A、B)。由于动物呼吸在同一检测位点成像组织范围会略有移动，因此在A、B图中的组织结构出现位移。此外，腹壁正中线上3个不同观察点的激光共聚焦成像图均显示组织中的白亮区域较多，即均含有大量混有荧光素钠的组织液；在其中分布着丝状结构的实体组织、胶原和弹性纤维，少量的类脂肪细胞和毛细血管(图2C，D)。不同深度、不同位点的组织图像中白亮区域均较多，表明任脉循行线组织中组织间隙大，组织液含量丰富。

注：A为A点检测深度8 μm，B为A点检测深度20 μm，C为B点，D为C点。浅箭头所示为毛细血管，深箭头所示可能为纤维结缔组织，稍浅箭头所示可能为毛细淋巴管。E为A、B、C观察位点示意，稍浅线上位点为腹中线水平旁开5 mm，浅线上位点为腹中线水平旁开1 cm图2 大鼠腹壁正中线(任脉)组织的活体激光共聚焦图(×1000)

2.2 大鼠腹壁非经脉循行线组织活体激光共聚焦成像特征

图3示，检测深度为20 μm时，A图任脉循行线组织中白亮区域较多，与任脉循行线B点平行旁开5 mm的腹壁组织D点处，成像视野中的白亮色区域减少，出现了大量排列紧密的直径约为20～40 μm的实体组织，为脂肪细胞；在旁开1 cm的E点处，白亮色区域面积显著减少，而且亮度减弱；视野中出现了大片的黑色区域为肌肉组织；在肌肉组织之间存在较细的线状白亮条带，这些长程的白亮线与片状的白亮区连通。这一结果提示，腹壁非经组织主要为实体组织，组织中的间隙空间和组织液含量远远小于腹中线沿任脉循行的部位。

注：A为B点，B为腹壁正中线水平旁开5 mm的D点，C为腹壁正中线水平旁开1 cm的E点图3 大鼠腹壁正中线(任脉)及其旁开组织的活体激光共聚焦图(×1000)

注： 与正中线垂直的腹壁组织横断面切片(100×)，B(40×)和C(200×)为与腹壁组织平行的切片，※所示为组织间隙，白箭头所示为阿尔新蓝(AB)标记的腹壁任脉线观察点，黑箭头所示为疏松结缔组织层，浅箭头所示为肌肉组织图4 大鼠腹壁正中线(任脉)及周围组织新鲜冷冻切片形态图

2.3 大鼠腹壁腹中线组织的形态结构特征

图4示，荧光显微镜下观察到，大鼠腹壁新鲜组织冰冻切片中绿色荧光浸染的为实体组织，暗色区域为组织间隙。在与腹壁表面垂直的组织切片中可以观察到，被AB标记的腹中线任脉上的观察点A(左侧腹壁表面黑色条带处)处下方是荧光染料浸染的疏松结缔组织层；其下方是较宽大的暗色空间，为组织间隙；间隙两侧是荧光染料浸染的肌肉组织，这些肌肉组织在AB标记点之外，即为任脉循行线两侧的非经线区域(图4A)。组织切片显示，大鼠腹中线组织具有比旁开组织较大的组织间隙，这一形态结构特征与激光共聚焦成像结果吻合。在与腹壁表面平行的组织切片中(包含腹中线的腹壁组织)，绿色区域为荧光染料浸染的肌束，暗色区域为组织间隙；在腹壁的肌纤维之中，分布着大小不等的间隙，纵横交错且相互连接沟通(图4B、C)。这一特征也与活体激光共聚焦成像结果一致。

3 讨论

人体组织中含有60%～70%的水，其中约2/3在细胞内为细胞内液，1/3为细胞外液。在细胞外液中，1/4为血液，3/4为组织液。早期的生理学教科书认为，组织液是不流动的凝胶态物质，直到1993年挪威的Aukland教授提出了组织液的两相说即凝胶相和液相，认为存在流动的组织液[7]，但是液相组织液的存在一直未得到证明。2007年，在一篇综述中报道瑞士的Swartz使用激光共聚焦显微镜，在离体组织中观察到一个10 μm的液态组织液颗粒，但并未介绍该研究详细的实验资料及其他实验室的验证工作[8]。直至2018年，美国Benias等使用激光共聚焦内窥镜在活体上观察到人体间质结构中存在液相组织液[3]。这是对组织液两相说的首次实验证明，将开启认识生命的新篇章。

组织液与经络实质密切相关的学术观点可追溯到上世纪60年代日本藤田六郎提出的经络脉管外体液路径说[4]，但该假说并未进行实验验证。20世纪80年代，孟竞璧等使用同位素示踪技术观察到在人体四肢穴位注射同位素后，可出现沿古典经脉循行路线迁移的示踪轨迹[9]。当时，对于同位素示踪轨迹的结构有各种猜测，孟竞璧认为是一种脉管外的小分子通道，但并未对循经示踪轨迹的形态结构进行深入研究。90年代以来，张维波提出经脉具有低流阻特性的假设，并运用组织液流动的达西定律和连续性方程，推论出组织液向经脉汇聚和沿经脉流动的流场模型[10]；随后使用改进的Guyton流阻方法证明了经脉的低流阻(高流导)特性[11]。同时，结合组织液压波传播的测量、同位素及AB示踪观察，最终发现循经低流阻通道[12]。他提出经脉(络)是结缔组织中流阻(液体流动的阻力)较低的连续多孔介质(孔隙度高、渗透性高)，组织液填充在其中。在生命活动过程中，一定范围内的组织液流动引起间质环境内物质、信息、能量的传递和交换，继而产生各种生物学效应。这一学说很好地与经络行血气的理论契合[13]。但由于当时尚缺乏能够直接观察活体的间质结构及其中组织液的技术，因此经脉低流阻组织液通道的观点未能得到最直接的实验证明。

对于经络实质结构的研究，自1963年朝鲜金凤汉以来，几乎所有对经络组织结构的研究都沿用常规的解剖或形态学技术进行组织结构观察。有研究者对组织中循经迁移的同位素进行放射性自显影观察，可辨识出同位素位于血管外的组织间隙中[14]，但放射性显影的分辨率很低，无法对间隙的具体形态结构进行显示，因此无法揭示同位素循经迁移轨迹的结构。蔡国平等曾对间质中的纤维成分进行形态学观察，组织固定脱水后无法真实还原间质的空间结构[15]。考虑到组织液本身及其对保持组织空间形态的重要性，张维波等用身体接近透明的彩裙鱼为研究对象，将AB染液注射到彩裙鱼的体内，当染料出现纵向迁移后立即进行整体冷冻，较完整地保留了组织间隙的结构和其中液体，在透射光下观察1 mm厚的新鲜冰冻切片，结果显示AB液 是在透明鱼的组织间隙之中迁移[16]，但该通道的细微结构特别是细胞外液体的分布仍难以观察。

活体激光共聚焦成像技术是在传统的电子内镜基础上整合了共聚焦激光显微镜而成，可对活体组织进行一定深度的断层扫描成像，并能排除聚焦平面之外组织的干扰，具有放大 1000 倍的能力，以亚微米的高分辨率实时精准捕捉活体组织成像，显示组织、细胞的显微结构，目前此技术已经在活体组织微区高分辨成像[17]、组织分子和微血管事件追踪[18]、癌细胞转移追踪等方面开展了应用[19]。经络低流阻组织液通道学说提出已有几十年，但直到活体激光共聚焦成像技术出现才有可能得到直接的证明，其将是研究经络的关键技术。本实验采用专用于动物实验的激光共聚焦成像系统在体观察大鼠腹壁循经组织的形态结构。由于此仪器探头的激光穿透深度有限，因此本实验是在剥离皮肤的大鼠腹壁表面进行的。

本实验采用的荧光素钠是一种易溶于水且无特异性亲和性的“水指示剂”，静脉注射后主要是存在于血管中，会随着血浆从毛细血管渗透入到组织中，成为组织液，并按照组织液流场规律向间隙较多且流阻较低的大间隙汇聚。在荧光成像系统的激光激发下，可用于显示组织中水的分布，同时可显示被荧光染料溶液包围浸染的组织、细胞的形态[20]。因此在活体组织中，以荧光素钠溶液所发荧光为背景，经过特殊光学成像处理，可无创地观察原位组织微区的形态学特征，特别是与组织液相关的结构，为活体研究生命活动和组织结构提供了极大的便利。

在本研究中，大鼠尾静脉注射荧光素钠溶液30 min后，在大鼠活体和新鲜腹壁任脉循行组织冰冻切片均观察到，腹壁组织中分布着大小不等、纵横交错充盈着组织液的组织间隙，这些大小不等的间隙纵横交错分布在组织中相互沟通连接。其中在腹中线任脉位置上的组织间隙较大，组织液的含量最多，符合任脉为诸阴经之汇的特征。而正中线两侧的组织主要为实体组织结构，组织间隙较小。此外，在任脉组织中发现分布着类似管道的结构，管道周围分布着组织液，且越靠近管道壁的荧光染料亮度越高，表明管道周隙的组织液量越丰富；在肌间隙中也观察到细长的组织间隙通道，充满了含有荧光素钠的组织液与周围组织连通。这一分布特征证明了张维波1997年对经络的低流阻假设和组织液的流场模型[11]。有研究者在肢体穴位注射荧光染料，用体视荧光显微镜观察到长程的被荧光染料浸染的血管周隙结构，认为这一通道结构与中医经络有关[21]。但此研究在穴位注射前将穴位远端血管与周围组织分离，在注射后局部组织间质的液压增加，这些因素均会引起组织间质空间的形变。实验显示，通道结构难以真实反映机体的间隙结构和组织液分布特征。此外，美国团队的研究尚未观察到间质中有通道样的结构存在，其专门介绍的胆外总管间质为多角形网状结构，组织液填充其中[3]，这种黑白相间的间质形态可能是管腔黏膜的特征间质组织液结构，与本研究在大鼠腹壁观察到的相互连通的组织间隙，以及条带样通道结构在性质和功能上可能存在一定的差异。

组织液在通道中流动时，在进入淋巴管内的同时还接受来自上游及周围组织的组织液，形成动态平衡。有序的组织液通道就像城市的排水沟，为淋巴液的高效率生成提供了条件。因此有研究者提出，组织液通道可称为组织通道(tissue channel)或前淋巴管(pre-lymphatics)[22]。组织液通道的上游源泉是毛细血管滤出液，其成分与去除血细胞后的血浆成分相同。组织液的正常流动可使细胞代谢物得到及时清除，并保证细胞周围的微环境与血浆接近，后者是全身生理调节的目标并时刻处于稳态中。但由于绝大多数细胞并不浸泡在血液里，而是在组织液的环境中，故将标准成分的血浆及时输送到细胞周围，使细胞周围的微环境保持稳态，对细胞的正常功能活动具有重要意义。因此可以认为，遍布于机体组织间隙中的组织液，其生物学特性与经络“行血气而营阴阳，濡筋骨，利关节”“决生死，处百病”的功能十分相似。此外，组织液和组织液通道是否具有沟通全身表里上下，平衡人体脏腑阴阳的功能以及传递病邪和针刺治疗信息等，有待进一步的实验研究探讨，以最终确定它与中医经络的关系。

本研究首次采用新型的激光共聚焦成像技术在大鼠体壁组织观察到纵横相交的组织间隙和组织液分布，以及长程的间隙通道存在，活体显示了循经组织与非经组织的组织液分布和形态特征差异，为中医经络实质研究提供了新的实验资料，这一技术的应用将为中医经络研究开辟新方向。对于初步观察到的这些特征结构尚需要更多的形态学证据进一步验证，而全身其他经脉循行区域的间质结构和组织液分布特征也有待进一步的观察研究。