姜黄素在小鼠肺成纤维细胞中的抗纤维化作用❋

2020-07-17刘代顺朱红兰

中国中医基础医学杂志 2020年4期

龚玲，刘代顺，朱红兰

(遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院呼吸内科)，贵州遵义 563002)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病[1]，临床主要表现为进行性呼吸困难，并伴随肺功能下降，该病病因不清，病变局限在肺脏，其特征表现为普通型间质性肺炎，该病每年以11%的比例增长[2-3]。IPF诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，因此被称为一种“类肿瘤疾病”[4]。姜黄素(curcumin, Cur)是二酮类化合物，近年的研究表明，它有一些新的药理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗纤维化以及防癌等作用，且无明显的毒副作用[5-7]。Smith MR等[8]报道，姜黄素可通过抑制TGF-β/Smad信号通路表达，从而抑制肺纤维化的形成。Lin J等[9]报道，在肝星状细胞中，姜黄素通过刺激PPAR-γ(peroxisome proliferater activated receptor, PPAR-γ)生成增加，从而抑制PDGF-β(platelet derived growth factor, PDGF-β)下游PI3K/AKT、ERK及JNK信号通路传导来抑制肝纤维化的发生。但是姜黄素在肺纤维化的发生发展中是否具有同样的作用，还有待进一步的考究。因此，本实验旨在通过PPAR-γ配体罗格列酮、PDGF-β探讨姜黄素在小鼠肺成纤维细胞中的抗纤维化分子机制，为进一步研究及临床治疗肺纤维化提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞

C57BL/6小鼠肺成纤维细胞(CRL-6013TM)购自美国American Type Culture Collection(ATCC)公司，实验中所用细胞均为第2～3代。

1.2 药物

姜黄素(C1386)购于美国Sigma Aldrich公司，10 mg/瓶，姜黄素纯度>99.5%，分子式：[HOC6H3(OCH3)CH=CHCO]2CH2，分子量：368.38。罗格列酮(Rosi)(R2408)购于美国Sigma Aldrich公司，10 mg/支，罗格列酮纯度>98%，分子式：C18H19N3O3S，分子量：357.43。

1.3 试剂

PPAR-γ兔抗小鼠(美国 Cellsignal)；PDGFR-β兔抗小鼠(美国 Cellsignal)；TGF-β2(美国 R&D Systems)；辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(美国 Cellsignal)；Trizol试剂(美国Invitrogen)；PCR试剂盒(日本TaKaRa)；PCR引物合成(中国生工)；DMEM(美国 Hyclone)；琼脂糖(美国Cambrex公司)；ELISA试剂盒(美国 R&D Systems公司)；MTT试剂盒(中国凯基公司)；DNA marker(日本TaKaRa公司)。

1.4 细胞培养

将细胞悬液移入塑料离心管中，加入DMEM培养基10 mL，混匀后低速离心5 min，小心弃上清液。重新加入DMEM(含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素)培养基重新混匀细胞，应用血球计数板进行计数，活细胞率95%，以每瓶1×106个/ml接种到10 cm2培养皿中，放置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱中进行培养。每隔2～3 d换液，细胞长至70%～80%融合状态时用于实验。

1.5 细胞药物处理

参照文献[10]，TGF-β2刺激浓度为10ng/ml。参照文献[11]，姜黄素使用二甲基亚枫溶解，刺激浓度为5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L。参照文献，Rosi[12]用二甲基亚枫溶解，刺激浓度为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L。

1.6 MTT实验

取对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，细胞培养24 h后设置调零孔，未处理组UNT，细胞分为TGF-β2组(10 ng/mL)、TGF-β2(10 ng/mL)+姜黄素组(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)、TGF-β2(10 ng/mL)+罗格列酮组(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)，每组设置3个复孔，分别培养0、24、48、72 h，检测生长抑制作用时吸去孔内上清液。酶联免疫监测仪检测各孔在490 nm处吸光光度并记录其结果。

1.7 细胞生长形态观察

相同密度的细胞分别接种于10 cm2培养皿中，根据MTT实验结果选取姜黄素、罗格列酮最佳浓度，将细胞分为空白组、TGF-β2 10ng/mL+姜黄素组50 μmol/L、TGF-β2 10ng/mL+罗格列酮组40 μmol/L，细胞培养24、48、72 h后用倒置显微镜进行观察。

1.8 RNA提取及聚合酶链反应

细胞分为空白组、TGF-β2组(10 ng/mL)、TGF-β2(10 ng/mL)+姜黄素组(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)、TGF-β2(10 ng/mL)+罗格列酮组(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)。细胞培养24 h后使用Trizol试剂提取总RNA，测定A260/A280吸光度判断纯度和浓度后，取2 μL总RNA使用cDNA反转录试剂盒进行反转录DNA。PCR反应过程：反应体系25 μL，94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个PCR循环，最后72 ℃总延伸10 min。检测PPAR-γmRNA、PDGF-βmRNA光密度值。

表1 PCR引物序列

1.9 免疫印迹实验

根据MTT实验结果选取姜黄素、罗格列酮最佳浓度，将细胞分为空白组、TGF-β2 10ng/mL+姜黄素组50 μmol/l、TGF-β2 10ng/mL+罗格列酮组40 μmol/L，药物干预48 h后采用Western blot法检测。实验步骤详见参考文献[14]。放射自显影后凝胶成像仪内扫描，图像分析软件(Quantity One4.1) 进行分析，以PPAR-γ、PDGFR-β的吸光度比值进行相对定量。

1.10 酶联免疫吸附试验

根据MTT实验结果选取姜黄素、罗格列酮最佳浓度，将细胞分为空白组、TGF-β2 10ng/mL+姜黄素组50 μmol/L、TGF-β2 10ng/mL+罗格列酮组40 μmol/l，培养24 h后收集培养基，离心提取上清后作为待测样品，实验步骤详见参考文献[13]。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 C57BL/6小鼠肺成纤维细胞活力、增殖情况

图1、2示，在TGF-β2刺激下，C57BL/6小鼠肺成纤维细胞活力、增殖均随姜黄素及罗格列酮浓度梯度增加和时间梯度增加受到明显抑制，TGF-β2+姜黄素组50 μmol/L在48、72 h时抑制C57BL/6小鼠肺成纤维细胞活力、增殖最明显，TGF-β2+罗格列酮组40 μmol/L在48、72 h时抑制C57BL/6小鼠肺成纤维细胞活力、增殖最明显(P<0.05)。

注：C57BL/6小鼠肺成纤维细胞用TGF-β210 ng/ml及不同浓度Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)和Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)分别作用，培养(0、24、48、72 h)后进行MTT实验。图A为Cur实验组，图B为Rosi实验组。 Cur实验组与空白组比较：P=0.000；Rosi实验组与空白组比较：P=0.000，差异有统计学意义。图1 姜黄素、罗格列酮对C57BL/6小鼠肺成纤维细胞活力的影响

注：C57BL/6小鼠肺成纤维细胞用TGF-β210ng/ml及TGF-β210 ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分别作用，培养(0、24、48、72 h)后进行镜下观察图2 姜黄素、罗格列酮对C57BL/6小鼠肺成纤维细胞增殖的影响(×200)

2.2 PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表达水平影响

图3示，姜黄素和罗格列酮均使PPAR-γmRNA表达上调且存在明显浓度依赖，姜黄素在50 μmol/L时PPAR-γmRNA表达上调最明显，罗格列酮在40 μmol/L时PPAR-γmRNA表达上调最明显。姜黄素和罗格列酮均使PDGF-βmRNA表达下调且存在明显浓度依赖，姜黄素在50 μmol/L时PDGFR-βmRNA表达下调最明显，罗格列酮在40 μmol/L时PDGF-βmRNA表达下调最明显(P<0.05)。

2.3 PPAR-γ、PDGFR-β蛋白表达

图4示，在TGF-β2刺激下，PPAR-γ蛋白表达增加，但当加入姜黄素及罗格列酮后，PPAR-γ蛋白表达增加更明显，说明姜黄素和罗格列酮均存在促进PPAR-γ蛋白生成增加的作用。在TGF-β2刺激下，PDGFR-β蛋白表达增加，但当加入姜黄素及罗格列酮后，PDGFR-β蛋白表达降低，说明姜黄素和罗格列酮均存在抑制PDGFR-β蛋白生成增加的作用(P<0.05)。

2.4 胶原蛋白-1生成影响

图5示，TGF-β2诱导胶原-1生成增加，但当加入姜黄素和罗格列酮后胶原-1生成减少，说明姜黄素和罗格列酮均抑制TGF-β2诱导胶原-1的生成(P<0.05)。

3 讨论

IPF主要表现为弥漫性肺间质纤维化伴随轻度炎症，成纤维细胞灶与正常肺组织并存，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的大量增生和沉积，使蜂窝组织的形成。该病典型临床表现为咳嗽、咳痰，动则气短、干咳、喘憋，后期出现进行性呼吸困难，还具有慢性、反复发作等特点。根据病因病机和临床表现，该病属于中医学“喘证” “肺胀” “气短” “痰饮” “咳嗽” “肺痹” “肺痿”等范畴。目前，现代医学对肺纤维化尚无有效的治疗措施。从近些年中医药治疗肺纤维化的研究文献中可以看到，随着中医辨证辨病治疗对该病病因病机研究的深入，中医药在治疗和控制该病上显现出越来越大的优势，中医可以减轻咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状，增加动脉血氧分压，缩短病程，改善生活质量等。但总体而言，本病研究尚处于起步阶段，因此利用中医学寻求有效的治疗方法，对IPF诊治具有深远意义。

注：C57BL/6小鼠肺成纤维细胞用TGF-β210 ng/ml及不同浓度Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)和Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)分别作用24 h后用PCR实验进行PPAR-γmRNA、PDGF-βmRNA检测。左图为TGF-β2+ Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)检测PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表达，右图为 TGF-β2+Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)检测PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表达。结果使用表示，姜黄素实验组：*P=0.002，罗格列酮实验组：*P=0.001，差异有统计学意义图3 PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA在不同浓度姜黄素、罗格列酮刺激下的表达

注：C57BL/6小鼠肺成纤维细胞用TGF-β210 ng/ml及TGF-β210ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分别作用，培养24 h后用Western blotting实验进行PPAR-γ、PDGFR-β蛋白检测。左图为检测PPAR-γ蛋白表达，右图为检测PDGFR-β蛋白表达。结果使用表示，TGF-β2刺激组与Rosi组比较：*P=0.000，TGF-β2刺激组与Cur组比较：*P=0.000，TGF-β2刺激组与Rosi组比较：**P=0.000，TGF-β2刺激组与Cur组比较：**P=0.001，差异有统计学意义图4 姜黄素、罗格列酮对PPAR-γ、PDGFR-β蛋白表达的影响

注：C57BL/6小鼠肺成纤维细胞用TGF-β210 ng/ml及TGF-β210ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分别培养24 h，用ELISA实验进行胶原-1检测。结果使用表示， Cur及Rosi 实验组分别与空白组比较：*P=0.019，*P=0.01，Cur及Rosi 实验组分别与TGF-β2刺激组比较：**P=0.005，**P=0.02，差异有统计学意义图5 姜黄素及罗格列酮对胶原蛋白-1的影响

姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物根茎中提取的一种化学成分，其中姜黄约含3%～6%，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物[11]。随着对姜黄素研究的日益深入，已发现其具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性。本实验研究发现，在TGF-β诱导C57BL/6小鼠肺成纤维细胞转化过程中发现，姜黄素不仅可以刺激PPAR-γ表达增加，还可以使PDGF-β表达下调。PPAR-γ表达增加不仅会抑制细胞增殖及活力，还可以使胶原-1表达减少，从而导致肺纤维化形成受阻。此外，PPAR-γ促使PDGF-β表达下调后可进一步导致细胞周期阻滞及凋亡增加，细胞增殖及活力受到抑制，同样可以阻碍肺纤维化形成。Lin J[10]等学者通过肝星状细胞证实，姜黄素可以通过刺激PPAR-γ表达增加，从而阻止PDGF-β下游信号通路的传导来抑制肝纤维化发生。因此，通过本实验推测，在TGF-β诱导肺成纤维细胞转化过程中，姜黄素刺激PPAR-γ表达增加后促使PDGF-β表达下调，从而导致PDGF-β下游的PI3K/AKT、ERK及JNK信号通路传导受抑制，肺成纤维细胞增殖和活力受抑制，胶原-1合成表达减少，肺纤维化形成受影响。但是为验证这一机制是否合理，还需要利用姜黄素通过动物实验进一步验证。

PDGF-β作为PDGF的受体亚单位，仅与PDGF B链有高亲和力。在肝纤维化时，肝星状细胞表面的PDGF-β与PDGF-BB结合后促进肝纤维化发生，抑制PDGF-β及其下游信号通路的传导，是抑制肝纤维化的关键点。由于PDGF-β在肝纤维化形成过程中的作用已经比较明确，结合本实验结果推测，在C57BL/6小鼠肺成纤维细胞转化过程中，TGF-β2促使PDGF-β表达上调，从而导致细胞增殖及活力增加，胶原沉积表达增加，然而姜黄素却通过刺激PPAR-γ表达增加来阻止PDGF-β及其下游信号通路传导，导致细胞周期阻滞及凋亡增加，细胞增殖及活力受到抑制，肺成纤维细胞转化受到影响，纤维化形成减少。此外结合本实验结果还推测，PDGF-β表达下调可能是通过抑制其下游的PI3K/AKT、ERK及JNK信号通路传导来阻止纤维化的发生，这与Kulkarni AA[14]等学者所证实的PPAR-γ配体通过抑制FAK下游的PI3K/AKT信号通路传导来阻止肺纤维化发生不谋而合。但为证实该机制是否正确，还需利用PDGF下游信号通路药物深入探讨。

罗格列酮是目前研究最多的PPAR-γ经典合成配体，是PPAR-γ的高选择性、强效激动剂，与PPAR-γ亲和力最大。越来越多的证据显示，罗格列酮不仅在炎症反应免疫调节中发挥着重要作用，还参与某些器官纤维化进程，如皮肤、肝脏、肺等。通过研究还发现，在TGF-β诱导小鼠肺成纤维细胞C57BL/6分化过程中，罗格列酮通过与PPAR-γ受体结合后刺激PPAR-γ表达增加，除了抑制细胞增殖及活力以外，还抑制胶原-1的表达。