中医综合外治法对肛瘘术后模型大鼠创面愈合指标的影响❋

刁翰林，徐 丽，程文秀，郁 悦，陈思儒，丁 楠，师 伟

(1. 山东中医药大学，济南 250014； 2. 山东大学附属省立医院，济南 250021； 3. 东中医药大学附属医院，济南 250014)

肛瘘(anal fistula，AF)近年发病率持续增高约4倍[1]，手术是其常规治疗手段。但是由于AF位置特殊，手术后创面愈合缓慢与疼痛成为临床常见问题。课题组前期研究证明，以中药外洗、电针刺激和耳穴压豆为主的中医综合外治法，可明显加快AF术后患者创面的愈合速度，促进VEGF、bFGF表达，提高患者血清P物质(substance p，SP)含量[2]。而速激肽1型受体(NKIR)是目前公认SP最敏感的受体。有研究表明，上调SP/NK1R可减少炎症反应[3]，促进VEGF与FGF-2释放[4-5]，加速血管修复与生成，对创面愈合起到促进作用。基于前期工作，本实验就中医综合外治法促进AF术后创面愈合的可能机制展开实验探索，以为临床提供新的思路与手段。

1 材料与方法

1.1 分组、造模及干预方法

1.1.1 动物与分组 选取12周龄、体质量(220±20)g的SD雄性大鼠共30只(动物批准号37009200007764)，按随机数字表法分为中医综合外治组(治疗组)、口服曲马多组(对照组)和模型组(空白组)，并分别编号、称重，每日自由进食、饮水。

1.1.2 饲养及造模方法 适应性喂养1周后，按照何永恒[6]等造模方法，将大鼠麻醉并待肛门松弛后，以肛缘为界，切开皮肤至直肠黏膜，创面修剪为三角形缺损(底宽1 cm，高2 cm)，损伤深度达肛门括约肌。

1.1.3 干预措施 图1示，各组大鼠俯卧位固定，以医用棉签蘸取碘伏溶液，反复擦拭创面5次至局部渗血，造成大鼠肛周创面的模拟临床换药刺激，每日1次。其中对照组于换药刺激前1 h给予3.25%盐酸曲马多溶液2 ml灌胃；治疗组于换药刺激前5 min给予免煎中药汤剂活血止痛散外洗，以完全浸透药液的2×2×2 cm医用棉球，控制药液温度45 ℃，将棉球紧敷于大鼠肛门创面并以多层厚纱布固定约5 min。根据《实验针灸学》[7-8]等文献定穴原则，选定大鼠长强穴、次髎穴，于换药刺激时使用韩氏穴位神经刺激仪将针灸毫针刺入穴位，给予经皮穴位电刺激操作，频率2 Hz，起始强度1 mA，持续5 min。后根据《实验针灸学》耳穴定位原则，以人耳穴定位类比大鼠耳穴定位，取肛门穴、直肠穴、交感穴，用棉签棒按压模拟耳穴压豆刺激；空白组不给予干预措施。

图1 耳穴位置示意图

1.2 实验器材及试剂

1.2.1 实验药物及手术器械 活血止痛散(鲁药制字Z2012003195)，按照同等剂量转换为规范中药免煎颗粒剂型(江阴天江药业有限公司)。药物组成：乳香15 g，没药15 g，赤芍20 g，制大黄30 g，五倍子15 g，白芷15 g，马齿苋30 g，元胡15 g，蒲公英30 g。盐酸曲马多片、碘伏等由山东大学省立医院中心实验室动物房提供。手术器械(组织剪、眼科剪、组织镊)、无菌棉球、生理盐水、福尔马林、麻醉药品等，由山东大学省立医院中心实验室动物房提供。

1.2.2 试剂与试剂盒 Western Blot相关试剂：蛋白质提取试剂盒、SDS-PAGE浓缩胶试剂盒、显影液及定影液购自碧云天生物技术有限公司；蛋白质浓度测定试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司，血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体购自Affinity公司；其余试剂均由山东大学省立医院中心实验室提供。ELIDA相关试剂：白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒均购自武汉基因美生物科技有限公司。PCR相关试剂：成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经肽P物质mRNA(SPmRNA)、NK1RmRNA引物购自上海博尚生物科技有限公司(引物序列见表1)，总RNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司，逆转录试剂盒、快速定量PCR试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司。

表1 引物名称序列

1.3 取材及保存

造模后常规饲养10 d，麻醉后固定大鼠，将大鼠腹中部皮肤去毛常规消毒、铺巾，心脏灌流处死，取大鼠创面组织立即置于液氮中暂存，于-80 ℃中长期保存。另取部分创面组织立即投入Trizol中，严格按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并将提取液及组织置于-80 ℃中保存。

1.4 检测指标及步骤

1.4.1 Western Blot法检测创面组织VEGF、bFGF及操作步骤 将创面组织置于匀浆器中于冰上研磨，严格按照说明书操作步骤进行蛋白质提取与浓度测定，加25%体积5×loading buffer后金属浴变性10 min，配置浓度10%的浓缩胶，按照30 V 60 min、80 V 90 min进行电泳，100 V 40 min进行转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜3次10 min，一抗4 ℃摇床孵育过夜；第2天取出，TBST洗膜3次10 min，二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次10 min，于暗室显影。

1.4.2 ELIDA法检测创面组织IL-1、IL-6、TNF-α及操作步骤 取组织匀浆，严格按照说明书操作，将标准品按照说明书操作方法梯度稀释后，另取待测样品孔加样10 μl并设空白孔，后于每孔加入酶标试剂 50 μl(空白孔除外)，封板膜封板并置37 ℃恒温箱温育 30 min，每孔加满洗涤液静置 30 s弃去，重复洗涤 5 次拍干，先后加入显色剂A、B各50 μl，37 ℃避光显色10 min，加终止液 50 μl，以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度，将结果带入回归曲线进行浓度计算。

1.4.3 PCR法检测bFGFmRNA、SPmRNA、NK1RmRNA及操作步骤 取100 mg左右组织加入裂解液RZ 1 ml，严格按试剂说明书操作步骤进行总RNA提取，并检测样本RNA的纯度与浓度；设置反应体系10 μL置于eppendorf仪，以37 ℃ 15 min、98 ℃ 5 min、70 ℃ 10 min进行逆转录，离心3 min后按照95 ℃ 1 s高温预变性，按95 ℃ 5 s、58 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，循环45次进行RNA扩增，上机进行mRNA定量分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠创面愈合情况

图2～4示，各组干预治疗10 d后观察创面愈合情况。浅色椭圆内为造模位置即创面位置。实验组与对照组创面均红润，有新鲜肉芽组织生长，其中实验组创面干燥，愈合良好，无炎性渗出物；对照组创面较干燥、愈合较好，可见极少量炎性渗出物，治疗效果较实验组稍差；空白组创面湿润，可见肉芽水肿，有较多炎性渗出物(如深色椭圆所示位置)，愈合较差。

图2 实验组创面

图3 对照组创面

图4 空白组创面

图5 Western Blot条带

2.2 Western Blot法结果

图5表2示,在bFGF方面与空白组比较，对照组与治疗组bFGF含量均升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，治疗组bFGF升高，差异无统计学意义(P>0.05)。在VEGF方面，对照组与空白组比较，VEGF含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组与空白组和对照组比较，VEGF含量均升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 ELIDA法结果

表3示，在IL-1与IL-6方面，对照组与空白组、治疗组与空白组、治疗组与对照组比较，IL-1与IL-6含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。在TNF-α方面，对照组与空白组、治疗组与空白组比较，TNF-α含量均降低，差异有统计学意义(P<0.01)；治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 bFGF、VEGF相对灰度值比较

表3 ELIDA法检测IL-1、IL-6、TNF-α 结果比较

2.4 PCR法结果

表4示，在bFGFmRNA方面与空白组比较，对照组与治疗组bFGFmRNA含量均升高，差异有统计学意义(P<0.01)；治疗组与对照组比较，bFGFmRNA升高，差异无统计学意义(P>0.05)，结果与Western Blot一致。在SPmRNA方面，对照组与空白组比较、治疗组与空白组比较、治疗组与对照组比较，SPmRNA含量均升高，差异有统计学意义(P<0.01)；在NK1RmRNA方面，对照组与空白组比较、治疗组与空白组比较、治疗组与对照组比较，NK1RmRNA含量均升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表4 PCR法检测bFGFmRNA、SPmRNA、NK1RmRNA结果比较

3 讨论

肛瘘术后属于中医学“金刃所伤”范畴，“脉络崩断”是其直接病机，基本治法为化瘀通络、理气止痛、收敛生肌[9]。现在大量文献报道，中药内服、中药熏洗、针灸与耳穴压豆可有效促进患者术后创面愈合[10]。本实验所采用的外洗方剂活血止痛散，方中乳香、没药、五倍子可行气止痛、消肿生肌，配伍元胡、马齿苋可加强止痛作用，赤芍、大黄、白芷与蒲公英清热凉血兼具解毒消肿，全方具有活血解毒、化瘀通络的功效。针刺长强穴与次髎穴可清热通便，活血化瘀，配合活血止痛散外洗，可以增强去腐生肌、活血止痛的作用。肛门穴、直肠穴和交感穴是肛瘘术后耳穴压豆的常用穴[11]，与汤药外洗、电针刺激相辅相成，三法并用加强止痛促愈效果。课题组前期证实[2]，活血止痛散汤剂外洗、电针刺激与耳穴压豆等中医综合外治法可明显提高AF术后患者创面愈合速度，降低创面肉芽组织生长的形态异常率。

研究表明，VEGF高表达，特异性结合血管内皮细胞膜上的受体酪氨酸激酶，从而激活其下游的相关基因表达，刺激血管内皮细胞分裂、增殖及迁移，诱导间质胶原酶的表达[12]，最终形成新生血管，对全身各组织血管的生长、增殖与迁移有显著效果[14]，促进肉芽组织及其血管内皮细胞与毛细血管的生长促进创面愈合[15]；bFGF可特异结合其具有酪氨酸激酶活性的受体激活PI3K/Akt通路[15-16]，使活化的Akt转移至胞内进一步活化下游靶点，从而促进细胞生长、增殖[17]，并与VEGF在创面愈合协同作用，加强止血与血管生成，共同促进创面愈合[18]。IL-1、IL-6和TNF -α作为炎症因子，可以加速炎症介质的释放，引起组织损伤，并与创伤程度成正相关[19]，可在一定程度上反映创面愈合速度。有实验证明，SP可以促进血管生成与创面愈合，降低炎症因子的表达[20-21]，应用NK1R拮抗剂又可延迟伤口愈合速度，加重炎症反应[22]，故而推测上调SP/NK1R通路加速血管生成参与创面愈合，可能与促进VEGF、bFGF及降低炎症因子释放有关。SP作为一种神经递质，可在中枢神经系统发挥止痛作用，于中脑PAG区促进内啡肽释放，同时SP在周围神经系统又可传递痛觉信息[23-24]；SP/NK1R高表达又可激活中脑导水管周围灰质的下行抑制系统[25]，通过调节5-羟色胺表达[26],平衡自感觉神经传入的伤害性疼痛电信号[27]，减弱痛觉自下而上的传递，在促进创面愈合因子释放的同时，抑制痛觉中枢兴奋，从而发挥止痛与促愈的双重效果。

炎性浸润是创面修复过程的启动环节，新血管生成是肉芽组织形成的重要标志，二者均可反映创面愈合情况。在本实验中，治疗组与对照组的bFGF与VEGF均升高，IL-1、IL-6与TNF-α均降低，提示中医综合外治法可促进创面肉芽组织的血管平滑肌细胞生长与毛细血管生成，并降低炎症反应，提高创面愈合速度，总体上中医综合外治法效果更好。同时本实验还发现，该2组大鼠SPmRNA与NK1RmRNA含量均升高，结合前文所述，提示中医综合外治法可通过上调SP/NK1R通路来参与肛瘘术后创面促愈过程。

综上所述，汤剂外洗、电针刺激和耳穴压豆刺激的中医综合治法可提高肛瘘术后模型大鼠的创面愈合速度，并可通过上调SP/NK1R关键通路来促进bFGF与VEGF表达，抑制IL-1、IL-6与TNF-α等炎症因子的表达，促进局部血管生成，降低炎症反应，从而实现促进创面愈合的作用。在减少抗生素使用、降低医院药物占比与促进肛瘘术后患者创面愈合方面，本实验可提供新的手段与思路。