结直肠癌中GOLPH3、CXCR7、CXCL12的表达及临床意义

李想才, 金川

遗传易感性、环境及老龄均是结直肠癌危险因素[1]。与其他恶性肿瘤类似,结直肠癌病死率高的重要原因是生长迅速、浸润性强且易转移，目前的主要治疗手段是在手术的基础上辅以放化疗,但仍有肿瘤复发及转移,预后不良[2]。因此早期诊断及对患者预后的研究具有重要的现实意义。分子遗传学和生物学的发展使越来越多的潜在致病基因被发现。GOLPH3可与逆向囊泡转运复合物相互作用,促进癌细胞增殖[3]。近年来提出“信号/归巢”的假说,即在配体的牵引下高表达的特定肿瘤趋化因子受体细胞会转移到相对应的靶器官中形成转移灶,使肿瘤细胞不断生长和增殖。CXCL12作为趋化因子,它可以在许多组织(包括脑、胸腺、心、肺、肝、肾、骨髓、脾脏)中表达,趋化因子CXCL12的受体是CXCR4,但最近有研究认为CXCL12还可以与CXCR7受体结合,且其结合力约是CXCL12/CXCR4趋化轴的10倍。本研究通过采用免疫组化法和Western blot法检测结直肠癌组织中GOLPH3、CXCR7、CXCL12的表达,探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集广东省惠州市中心医院博罗分院2017年4月到2018年9月手术切除并经病理确诊的结直肠癌患者60例,包括35例男性,25例女性,年龄24～83岁,其中结肠癌24例,直肠癌36例;另取癌旁60例正常大肠黏膜组织(距结直肠癌远端≥10 cm,经诊断无癌组织浸润)做对照组。所有研究对象均接受规范化治疗;病历资料完整;所有标本均在离体30 min内采集。排除良性结直肠肿瘤者;患有严重基础疾病者;资料不完整者。研究方案经我院医学伦理委员会批准,并与患者签订知情同意书。

1.2 检测方法免疫组化法 采用SP两步法检测60例结直肠癌组织以及60例正常黏膜大肠组织，操作严格按照说明书进行，石蜡切片，二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化，柠檬酸高温修复抗原，过氧化氢室温孵育 10 min，封闭过氧化物酶，加入兔抗人GOLPH3、CXCR7、CXCL12多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，37 ℃复温，PBS 冲洗 3 遍，二抗 37 ℃孵育 30 min，PBS 冲洗 3 遍，DAB 显色，苏木素复染，自来水冲洗后蓝化，乙醇脱水，最后中性树胶封片。

Western blot法:取-80 ℃冰箱中新鲜结直肠癌组织提取总蛋白,用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。然后上样、电泳、转膜,放入含5%脱脂奶粉的TBST进行封闭,37 ℃保温箱90 min;在装有一抗封闭液的杂交袋中过夜,采用TBST液洗膜5次,每次8 min;加二抗封闭液封闭PVDF膜,37 ℃孵育2 h后曝光,观察结果。采用Lab Works 4.5分析系统软件(美国UVP公司)对Western条带进行定量分析,各组目的蛋白的相对表达水平。

1.3 结果判断 GOLPH3免疫组化阳性主要定位于细胞浆,以癌细胞胞浆出现棕黄色至棕褐色颗粒沉着者为GOLPH3表达阳性。CXCR7和CXCL12免疫组化阳性主要定位于细胞膜和细胞质中,以癌细胞胞膜和(或)胞质出现棕黄色至棕褐色颗粒沉着者为CXCR7、CXCL12表达阳性。每张切片随机选取5个视野,计数500个细胞,根据染色强度及阳性细胞数的百分率评分进行分级,两项评分之和>2分即为阳性,≤2分则计为阴性。细胞染色强度计分:无染色0分;出现淡黄色颗粒沉着且强度明显高于背景1分;出现棕黄色颗粒2分;出现大量棕褐色颗粒3分。阳性细胞百分率计分:阳性细胞数≤5%为0分;5%﹤阳性细胞数≤25%为1分;25%﹤阳性细胞数≤50%为2分;阳性细胞数﹥50%为3分。

1.4 统计学方法 采用 SPSS22.0软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验,相关性分析采用Spearman等级相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在结直肠癌组织和正常黏膜组织中GOLPH3、CXCR7、CXCL12的表达 见图1。GOLPH3在结直肠癌组织和正常大肠组织中的阳性表达率分别为53.3%(32/60)和21.7%(13/60),差异有统计学意义(P<0.05);CXCR7在结直癌组织和正常组织中的阳性率分别为66.7%(40/60)和41.7%(25/60),差异有统计学意义(P<0.05);CXCL12在结直肠癌组织和正常大肠组织中的阳性表达率分别为78.3%(47/60)和5%(3/60),差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

表1 GOLPH3、CXCR7和CXCL12在结直肠癌及癌旁组织中的表达(%)

2.2 GOLPH3、CXCR7和CXCL12的表达率与其临床病理参数的关系 在结直肠癌患者中,GOLPH3、CXCL12阳性表达率与淋巴结转移有关(P<0.05);CXCR7阳性表达率与分化程度、TNM分期、病理类型有关(P<0.05),详见表2。

1A为GOLPH3在结直肠癌组织中的表达,图中细胞胞浆出现棕黄色、棕褐色颗粒沉着;1C为CXCR7在结直肠癌组织中的表达,图中细胞膜和胞质出现棕黄色、棕褐色颗粒;1E为CXCL12在结直肠癌组织中的表达,图中细胞膜和胞质出现棕黄色、棕褐色颗粒沉着。1B、1D、1F分别代表GOLPH3、CXCR7、CXCL12在正常大肠组织中的表达,呈阴性图1 GOLPH3、CXCR7和CXCL12蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达

表2 GOLPH3、CXCR7和CXCL12的表达与结直肠癌临床病理特征之间的关系[例(%)]

2.3 GOLPH3、CXCR7和CXCL12在结直肠癌组织中蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果 GOLPH3蛋白在结直肠癌组织中的相对表达强度为(34.95±8.11)高于正常大肠组织中的相对表达强度(11.67±5.23),差异有统计学意义(t=-10.79,P<0.001);CXCR7蛋白在结直肠癌组织中的相对表达强度为(67.56±16.01)高于正常大肠组织中的相对表达强度(24.00±16.43),差异具有统计学意义(t=-9.57,P<0.001);CXCL12蛋白在结直肠癌组织中的相对表达强度为(87.00±18.23),高于正常大肠组织中的相对表达强度(28.92±10.13),差异具有统计学意义(t=-12.46,P<0.001)，详见图2。

注：2A中 1、3、5分别代表GOLPH3、CXCR7、CXCL12蛋白在结直肠癌组织中的表达,2、4、6分别代表GOLPH3、CXCR7、CXCL12蛋白在癌旁正常大肠组织中的表达;2B为内参GAPDH图2 GOLPH3、CXCR7和CXCL12蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果

2.4 GOLPH3、CXCR7和CXCL12在结直肠癌表达中的相互关系 采用Spearman等级相关分析表明,GOLPH3与CXCL12蛋白在大肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.42,P=0.002),CXCR7和CXCL12蛋白在大肠癌组织中呈正相关(r=0.44,P=0.010)。

3 讨论

结直肠癌的发生是内因和外因即基因和环境相互作用后产生的结果,其中原癌基因的激活被认为是促发结直肠癌的关键机制之一。当前,药物靶向直接针对癌细胞的治疗手段受到广泛临床工作者的关注,分子靶向治疗成为肿瘤领域的研究热点。在恶性肿瘤的增殖过程中,某些原癌基因的激活或抑癌基因的失活导致了肿瘤细胞中特定蛋白的异常表达[3],因此,探索特定蛋白在肿瘤发生、发展过程中表达变化,对于肿瘤的诊断及靶向药物的开发意义重大。本文采用免疫组化和Western blot法检测结直肠癌患者组织GOLPH3、CXCR7和CXCL12的表达,分析了三种标志物的表达与结直肠癌临床病理特征之间的关系。结果表明,GOLPH3、CXCR7、CXCL12在结直肠癌癌组织中高表达,而在正常的癌旁大肠组织中不表达或微表达,在结直肠癌患者中,三种标志物与某些临床病理特征关系密切,提示GOLPH3、CXCR7和CXCL12可能参与了结直肠癌发生发展的过程。

GOLPH3主要富集在高尔基体囊泡反面的膜外围,也存在于小管、囊泡、内腔和质膜中,主要发挥蛋白质转运的作用[4]。2009年,在细胞生物学和生物化学领域, GOLPH3被认为是一个致癌基因[5-6]。现国内外文献已有报道GOLPH3在前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、食管癌等多种肿瘤中高表达,而在正常组织中无表达或低表达[7-10]。本实验免疫组化和Western blot检测结果均显示在结直肠癌组织中GOLPH3的阳性率和蛋白表达水平高于癌旁正常组织(P<0.05),表明GOLPH3可能在结直肠癌的发生过程中起重要作用。有文献指出GOLPH3通过调节糖基化转移酶从而引起糖基化蛋白的分泌失常[11]。而目前已证实肿瘤细胞的生长、粘附、迁移与侵袭以及免疫识别与糖基化结构密切相关,糖基化结构的异常变化会导致肿瘤的侵袭性增加,因此GOLPH3在一定程度上可间接影响肿瘤细胞。本研究在GOLPH3与结直肠癌组织临床病理特征的分析中发现GOLPH3的表达与淋巴结转移有关,发生淋巴结转移时表达率会升高,说明GOLPH3在一定程度上可反映出结直肠癌的恶性程度,可作为结直肠癌生物学行为的指标。

一直以来,炎性反应趋化因子在肿瘤细胞生长、迁移过程中起着重要的作用,同时还影响免疫细胞对肿瘤细胞的渗入[12]。在肿瘤细胞表达的相应受体介导下,炎性反应趋化因子能对特定器官合成的同源配体进行应答,然后肿瘤细胞通过趋化因子浓度梯度进行迁移[13]。CXCL12属于趋化因子家族成员之一,又称基质细胞源性因子-1,是一种多效性的趋化因子,在脑、肺、结肠、心脏和肝脏等组织中广泛表达,能刺激多种信号转导。CXCR7作为与细胞膜相关受体之一,在正常细胞中表达较少,但在脑源性神经元、活化内皮细胞等细胞中高表达。在肿瘤细胞增殖过程中,CXCR7作为CXCL12的一种新型受体, CXCL12/CXCR7生物轴与CXCL12/CXCR4有类似的生物效应[14-16]。现有研究表明CXCR7蛋白在肺癌、前列腺癌等肿瘤细胞中起着促进其增殖、抑制死亡等作用,它的高表达可能在肿瘤侵袭和转移的过程中发挥了重要作用,但其在结直肠癌领域的研究还较少。本研究发现,CXCL12和CXCR7在结直肠癌组织中表达率高于癌旁正常组织(P<0.05),研究中CXCR7在结直肠癌中的高表达与病理类型、淋巴结转移、TNM分期密切相关,CXCL12在结直肠癌组织中的高表达则与淋巴结转移密切相关,提示二者可作为判断结直肠癌有无淋巴转移的生物学标志物,同时CXCR7还与其他病理特征密切相关,提示二者联合检测能促进结直肠癌发生发展、浸润转移等。本研究结果还显示,GOLPH3与CXCL12、CXCL12与CXCR7呈正相关,有文献指出在结直肠癌发生发展过程中GOLPH3、CXCR7、CXCL12与mTOR信号通路有关,并上调VEGF表达,对肿瘤发展起到促进作用,由此可以预测三者的联合检测等进一步研究,可以指导临床运用。

综上所述,GOLPH3、CXCR7和CXCL12在结直肠癌侵袭转移中起协调作用,GOLPH3、CXCR7和CXCL12表达的升高预示肿瘤有高度侵袭性、高度转移性潜能,进一步探究三者的作用及相互关系有助于阐明结直肠癌转移的机制,为提供结直肠癌转移基因标记物及靶向治疗提供新思路。