血浆D-二聚体在胰腺癌患者中的临床意义

王文闻, 肖燕, 王琦

在胰腺癌患者中,近乎持平的发病率与死亡率预示了其极差的预后,因此胰腺癌日益受到医学工作者的关注。即使在有机会接受根治术的相对早期胰腺癌患者中,术后短期内的复发也是患者生存期短暂的重要因素[1-2]。肿瘤的发生发展与生长、浸润、转移等行为密切相关;因此如何监测并早期预测肿瘤的恶性行为,从而对根治术后复发的患者进行可能的早期干预也成为延长患者生存期的策略之一。D-二聚体(D-dimer)作为一种特异性的蛋白降解产物,常被视为机体高凝状态和纤溶过程的标志物;近年来进一步研究发现D-二聚体与包括胰腺癌在内的恶性肿瘤进展密切相关[2-4]。本研究以接受根治术的胰腺癌患者为观察对象,分析血浆D-二聚体水平与患者病理临床特征的相关性,并进一步随访胰腺癌患者术后至复发过程D-二聚体变化趋势。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年10月至2018年11月在南京医科大学附属无锡市第二人民医院行胰腺癌根治术的患者,入选的44例胰腺癌患者中男29例,女15例;年龄45～81岁,中位年龄62.5岁;肿瘤组织分化程度:高分化1例,中分化36例,低分化7例;TNM分期:Ⅰ期27例,Ⅱ期15例,Ⅲ期2例;有淋巴结转移者12例。研究方案通过本院医学伦理委员会批准通过，患者及家属均签署知情同意书。

纳入标准:术前无远处转移;未接受放疗、化疗等抗肿瘤治疗;经病理学确诊为胰腺癌。排除标准:伴有感染、心脑血管疾病、深静脉血栓栓塞症、弥散性血管内凝血;3个月内服用过糖皮质激素;6个月内接受过抗凝治疗。调取上述44例患者在病理科存档的术后组织蜡块,病理科医师复查苏木精-伊红(HE)染色确认为胰腺癌标本。

1.2 血浆D-二聚体、血清糖类抗原19-9(CA19-9)检测 所有研究对象均在清晨空腹抽取静脉血3～5 ml,储存于真空采血管中,离心收集上清液。D-二聚体采用胶乳凝集法,CA19-9采用化学发光法进行检测。指标正常范围:D-二聚体0～0.23 μg/ml、CA19-9 0～35 U/ml,超出上限值即为异常。以术前血浆D-二聚体值为参考,将患者分为D-二聚体正常组(0～0.23 μg/ml,0.18±0.04 μg/ml)和D-二聚体异常组(>0.23 μg/ml,0.84±1.13 μg/ml)。

1.3 免疫组织化学染色法测定蛋白表达水平 标本连续切取4 μm切片,组织片经烘烤、脱蜡、水化后行热修复抗原,冲洗后滴加50 μl一抗[乙醛脱氢酶1a1(ALDH1a1)美国Proteintech公司产品,人类表皮生长因子受体2(HER2)、P53为福州迈新生物技术开发有限公司产品],4 ℃冰箱过夜。次日复温冲洗,每张切片滴加 50 μl二抗(北京中衫生物制品有限责任公司产品),DAB显色,苏木精复染,分化、脱水、透明后,封片、镜下查看切片。免疫组化结果判断:400倍光镜下每张切片随机取10个高倍视野计数阳性细胞,取平均值为结果。蛋白表达水平评判标准:细胞无着色或着色细胞数占总细胞数<5%为0分;着色细胞数占总细胞数为5%～25%为1分;着色细胞数占总细胞数为26%～50%为2分;着色细胞数占总细胞数51%～75%为3分;着色细胞数占总细胞数76%～100%为4分。阳性细胞着色强度:细胞无着色0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。两者相乘:0分为阴性(-);1～4分为弱阳性(+);5～8分为中等阳性(++);9～12分为强阳性(+++)。用试剂公司提供的阳性对照图在同一条件下染色作为阳性对照,用PBS液替代一抗作为阴性对照[5]。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示;独立样本t检验比较D-二聚体正常组和D-二聚体异常组之间的差异;配对样本t检验比较术前初诊和复发D-二聚体水平;四格表配对χ2检验比较D-二聚体和各蛋白表达水平之间的相关性;采用Kaplan-Meier法进行生存分析。P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 术前D-二聚体水平与术后无病生存期的关系 44例患者中,34例随访至影像学检查或临床提示肿瘤复发,19例复发后失去随访机会。D-二聚体正常组无病生存期(中位无病生存期为350 d±59 d,平均无病生存期为610 d±158 d)长于D-二聚体异常组(中位无病生存期为142 d±19 d,平均无病生存期为178 d±27 d),差异有统计学意义,见图1。

图1 血浆D-二聚体水平与患者无病生存期的关系

2.2 D-二聚体水平与临床病理特征的关系 术前血浆D-二聚体水平与胰腺癌患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小无显著相关性;D-二聚体异常组肿瘤组织低分化率及区域淋巴结转移率高于D-二聚体正常组,但差异无统计学意义,见表1。

表1 血浆D-二聚体水平与胰腺癌患者临床病理特征之间的关系

2.3 D-二聚体水平与疾病状态的相关性 相比初诊时期,胰腺癌患者复发时的D-二聚体水平增高,见图2。

注:胰腺癌患者复发时期的D-二聚体水平显著高于术前初诊时图2 D-二聚体水平与患者疾病状态的关系

在本次研究中,能追踪到术后至复发,获取CA199和D-二聚体动态变化的仅4例。随访了这4例胰腺癌患者疾病各个阶段的D-二聚体水平;CA19-9是公认的胰腺癌肿瘤指标[2],因此我们进一步对比了D-二聚体和CA19-9的水平。在疾病进展过程中,D-二聚体和CA19-9的变化趋势具有一致性,术后可有下降,在复发时表现为再度升高,见图3。

2.4 血浆D-二聚体水平与肿瘤组织ALDH1a1、HER2、P53蛋白表达水平的关系 依据免疫组织化学染色结果显示,ALDH1a1蛋白表达定位为细胞质;HER2蛋白表达定位为细胞膜;突变型P53蛋白表达定位为细胞核。D-二聚体水平与突变型P53蛋白表达无显著相关性,D-二聚体异常高水平与ALDH1a1、HER2蛋白高表达显著相关,见表2。

注:胰腺癌患者肿瘤初诊(术前)、术后、复发期的D-二聚体、CA19-9水平变化趋势具有一致性,且在术后降低,复发时升高图3 D-二聚体与CA19-9的关系

表2 血浆D-二聚体水平与ALDH1a1、HER2、P53蛋白表达水平的关系(例)

3 讨论

在本研究中,我们发现术前D-二聚体异常预示患者无病生存期短;在整个疾病进程中,D-二聚体水平伴随疾病好转而降低,进展而升高,与CA19-9变化趋势相一致;相比初发期,患者在复发时普遍具有更高水平的D-二聚体。与我们观察到的相类似,既往研究发现在肿瘤可切除的胰腺癌患者中,D-二聚体可预测总生存期及无病生存期,甚至优于CA19-9;在肿瘤不可切除的胰腺癌患者中,高D-二聚体水平也与短生存期相关,这些奠定了D-二聚体作为预后预测因子的潜能[2-3,6]。

恶性肿瘤患者的血液通常表现为纤溶亢进及高凝状态,暗示肿瘤进展与继发性纤溶、凝血系统过度激活密切相关[4,7]。研究表明,处于纤溶凝血系统过度激活的环境中,肿瘤细胞释放激活外源性凝血系统的促凝物质,导致凝血异常,纤溶酶原活化后在局部产生纤溶酶,使得细胞外间质被降解,这一系列过程可促进肿瘤侵袭;同时释放的各种因子可促进血管内皮细胞增殖分化,纤维蛋白的重塑,进一步形成新生血管、为肿瘤提供异常血供;纤维蛋白原还可提高微循环肿瘤细胞的粘附性,为肿瘤转移提供有利条件[4,7-9]。此过程涉及的纤维蛋白单体,经活化的因子XII交联,再经纤溶酶水解,以产生特异性降解产物,即我们研究中关注的D-二聚体[2]。基于既往研究报导,我们从理论上推测D-二聚体水平可间接反映肿瘤侵袭转移的程度。

对比D-二聚体正常组,我们发现D-二聚体异常组患者肿瘤组织ALDH1a1、HER2蛋白显著高表达。研究表明,肿瘤干细胞可逃避常规抗肿瘤治疗得以长期生存,因而与肿瘤远期复发相关,ALDH1a1被证实为胰腺癌干细胞的标志物[10-12];HER2过表达可通过影响黏附分子、基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子等促进肿瘤侵袭转移[13]。大量临床研究发现,ALDH1a1高表达与食管癌、胃癌、胆管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的肿瘤浸润、淋巴结转移等恶性行为以及差预后相关[14]。另有研究表明HER2阳性的乳腺癌患者D-二聚体水平高于HER2阴性的患者,与我们在胰腺癌观察到的相一致[15]。因此我们推断D-二聚体异常胰腺癌患者易发生复发转移的机理可能与ALDH1a1、HER2蛋白高表达相关。

综上所述,D-二聚体可作为胰腺癌监测预测因子;术前血浆D-二聚体异常的患者术后复发快,预后差,应加强监测,提供及时有效的干预。本研究存在样本量少的缺陷,今后需大样本多中心进行验证,在机制方面也需要深入挖掘D-二聚体在肿瘤进展中的作用。