凡纳滨对虾蛋白体外降脂作用分析

龚受基,蒙彦妃,曹惠怡,刘忠义

(北部湾大学食品工程学院,广西钦州 535011)

凡纳滨对虾(penaeusvannamei)是当今世界养殖产量最高的三大虾类之一,不仅营养丰富、肉质鲜美,还具有很高的营养价值。研究发现对虾水解物中存在二肽基肽酶IV和脯氨酸寡肽酶抑制剂,可以获得可溶性蛋白质/肽、潜在的降血糖和抗抑郁化合物(DPP-IV和PO抑制肽),具有潜在的保健食品开发功能[1-2]。

高脂血症是现代社会代谢性疾病的典型症状,大多表现为肥胖、BMI高、血清中胆固醇或甘油三酯含量高,高脂血症易诱发心脑血管疾病,属于现代公共卫生的重大问题。传统经验和科学研究表明,鱼蛋白等多种来源蛋白质能够降低胆固醇和甘油三酯,改善高脂血症[3]。鲱鱼鱼子蛋白不但降低小鼠的脂质水平,而且改善葡萄糖代谢[4]。鱼蛋白的酶解产物降低了胆固醇胶束溶解性,增加了胆汁酸结合能力,通过增加粪便胆固醇和胆汁酸排泄从而达到降胆固醇的目的[5]。鱼蛋白对血浆和肝脏脂质水平影响机制多样,但有证据表明与调节脂质代谢平衡的基因表达相关[6-7]。牡蛎蛋白水解物可以降低脂肪酸合成酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性,抑制脂肪生成而降低甘油三酯水平[8]。以抑制蛋白自溶的鱿鱼匀浆为添加剂,可以降低大鼠血清甘油三酯和胆固醇,其机制与调节小肠血脂代谢、抑制肝脏脂肪生成有关[9]。虾、鱿鱼、章鱼作为蛋白质分别添加到基础饮食中,所有实验组小鼠的胆固醇水平都有不同程度降低[10]。

降脂研究方法较多,主要有动物体内实验、细胞实验、化学方法实验等,动物体内实验、细胞实验评价降脂研究过程烦杂、实验条件要求高,而体外化学降脂评价对实验设备要求较低,主要从作用机制出发,一般实验室都可以完成,不失为降脂成分筛选的有效方法,可以对大规模样品进行快速筛选。本实验针对不同等电点凡纳滨对虾蛋白的体外降脂作用进行了初步研究,以胆酸盐吸附能力、胰脂肪酶抑制率、降胆固醇作用、胆固醇酯酶反应作用等为研究指标,对凡纳滨对虾蛋白不同pH沉淀组分降脂特征进行研究,以期为凡纳滨对虾的开发及其保健作用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活对虾 采购于广西壮族自治区钦州市钦南区城东市场,经北部湾大学海洋学院方怀义副教授鉴定为凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei);福林酚试剂、橄榄油、胆固醇酯酶(≥300 U/g) 阿拉丁试剂(上海)有限公司;牛磺胆酸钠、胰脂肪酶(来自猪胰脏,≥500 U/mg) 东京化成工业株式会社;甘氨胆酸钠、脱氧胆酸钠 九鼎化学(上海)科技有限公司;考来烯胺 武汉东康源有限公司;胃蛋白酶(≥1200 U/g) 上海展云化工有限公司;胰蛋白酶(4000 U/g) 北京奥博星生化科技有限公司;结晶牛血清白蛋白 上海新睿生物科技有限公司;胆固醇 阿法埃莎(天津)化学有限公司;对硝基苯基丁酸酯 天津希恩思生化科技有限公司。

CVCFD5-3冷冻干燥器 SIM(美国)国际集团有限公司;Mikro220R冷冻离心机 德国Hettich科学仪器有限公司;1800可见光分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 将采购鲜活的凡纳滨对虾清洗干净,然后放置于冷冻干燥托盘中于冰箱冷冻层预冻一昼夜,接着取出冷冻好的凡纳滨对虾放进冷冻干燥器进行冷冻干燥3 d,最后将冷冻干燥好的凡纳滨对虾用粉碎机进行粉碎,收集好备用。

1.2.2 蛋白质含量测定 参照Folin-试剂盒说明,以结晶牛血清蛋白为对照品,测定凡纳滨对虾蛋白质含量。

新鲜对虾匀浆,称取0.5 g对虾匀浆分散于20 mL蒸馏水,搅拌后过滤得滤液。吸取0.5 mL滤液于50 mL容量瓶中,定容。量取上述定容好的溶液1 mL于试管中,加Folin-试剂甲5.0 mL,30 ℃条件下反应10 min,然后加Folin-试剂乙0.5 mL,30 ℃条件下反应30 min,反应结束后于500 nm处测吸光度值,测定三组取平均值。

样品中蛋白质含量(mg/g)=C×V1×V2×W×1000

式(1)

式中,C:查标准曲线值(μg);V1:提取液总体积(mL);V2:测定时吸取体积(mL);W:样品重量(g)。

1.2.3 凡纳滨对虾蛋白分离 参考Chen等[1]提取分离蛋白质方法并加以修改,对蛋白质最佳碱溶pH进行研究。取6个250 mL三角瓶并编号,按1∶10的比例称取2 g凡纳滨对虾粉末溶于20 mL预冷过的蒸馏水中,分别用0.2 mol/L氢氧化钠溶液将三角瓶内溶液的pH调至8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0,然后用快速混匀器振荡3 min,冰浴条件下搅拌30 min后,10000 r/min、4 ℃离心15 min,分别收集6种pH的沉淀和上清液,上清液采用福林酚法测定吸光值,计算出上清液蛋白质含量,沉淀蛋白质量由溶液中蛋白总质量减去上清液中蛋白质量所得,根据6种操作的沉淀蛋白质量筛选出最佳碱溶pH。在上述操作中,分别收集pH8的沉淀和上清液;然后把沉淀溶于水,盐酸调整pH至中性,冷冻干燥得pH8组分。收集pH8组分后的上清液采用福林酚法测定吸光度值,计算出蛋白质含量。该上清液用碱调整pH为9.0,如上述操作收集沉淀干燥得pH9组分,收集pH9组分后的上清液同样测定吸光度,计算pH9组分质量。参照上述操作分别分离得pH10、pH11、pH12和pH13组分。

在上述筛选最佳碱溶pH研究中,pH为10时蛋白质含量最高,确定最佳碱溶pH为10。重新取对虾粉末溶于水中,调整pH为10。然后用0.1 mol/L盐酸调节pH至3.0,10000 r/min、4 ℃离心15 min,分别收集沉淀和上清液,上清液采用福林酚法测定吸光值。收集的沉淀调节pH至中性,冷冻干燥得pH3组分;收集pH3组分后的上清液用碱调整pH为4.0,如上述操作收集沉淀干燥得pH4组分。参照上述操作分别得组分pH5、pH6和pH7组分。

对分离得到的pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10等组分进行针对胆酸盐、胰脂肪酶、胆固醇和胆固醇酯酶等体系进行体外降脂作用研究。

1.2.4 蛋白组分对胆酸盐吸附能力的测定 参考刘淑敏等[11]方法并加以修改,对胆酸盐吸附能力进行测定。

1.2.4.1 蛋白组分对牛磺胆酸钠吸附能力的测定 取12支25 mL试管,编号后分别加入2 mg/mL的考来烯胺溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.0 mL,用蒸馏水补足1 mL,使每支试管中考来烯胺含量分别为0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg。接着加4 mL模拟胃液,放在37 ℃水浴消化60 min。然后用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液至pH=6.3,紧接着加入模拟肠液4 mL继续在37 ℃水浴消化60 min。随后加4 mL牛磺胆酸钠溶液继续在37 ℃水浴中反应60 min后取出,在40000 r/min转速下离心20 min。取2.5 mL离心后的上清液放于干净的25 mL试管中,加7.5 mL 60%的硫酸,在70 ℃水浴中水浴20 min后取出立即冰浴5 min,在387 nm处测吸光度值。根据测定结果计算考来烯胺吸附牛磺胆酸钠标准曲线。

称取0.1 g冷冻干燥蛋白粉末,溶于100 mL蒸馏水中,吸取1 mL样液,加入4 mL模拟胃液,在37 ℃水浴消化60 min后,用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH=6.3,接着加入4 mL模拟肠液继续在37 ℃水浴消化60 min后,再加4 mL牛磺胆酸钠溶液,在37 ℃水浴中反应60 min,取出后4000 r/min离心20 min,取2.5 mL上清液放于干净的25 mL试管中,加7.5 mL 60%的硫酸,70 ℃水浴20 min后立即冰浴5 min,在387 nm测定吸光度值,计算蛋白样品对牛磺胆酸钠的吸附。

ΔC=C0-C

式(2)

式中,ΔC:蛋白样品对牛磺胆酸钠的吸附浓度;C0:加入牛磺胆酸钠浓度;C:反应后上清液牛磺胆酸钠浓度。

参考考来烯胺吸附牛磺胆酸钠标准曲线,然后以蛋白样品和考来烯胺浓度均为1 mg/mL时对牛磺胆酸钠吸附率的相对百分率衡量蛋白吸附能力。

式(3)

式中,Ac:蛋白对牛磺胆酸钠的相对吸附能力;Ar:1 mg/mL蛋白样品对牛磺胆酸钠吸附率;Aro:1 mg/mL考来烯胺对牛磺胆酸钠吸附率。

1.2.4.2 蛋白样品对甘氨胆酸钠吸附能力的测定 以甘氨胆酸钠替代牛磺胆酸钠按上述操作测定考来烯胺吸附甘氨胆酸钠方程;同时按照上述蛋白样品吸附甘氨胆酸钠操作,按式(2)和式(3)计算蛋白样品相对考来烯胺吸附甘氨胆酸钠能力。

1.2.4.3 蛋白样品对脱氧胆酸钠吸附能力的测定 以脱氧胆酸钠替代牛磺胆酸钠按上述操作得测定考来烯胺吸附脱氧胆酸钠方程;同时按照上述蛋白样品吸附甘氨胆酸钠操作,按式(2)和式(3)计算蛋白样品相对考来烯胺吸附脱氧胆酸钠能力。

1.2.5 蛋白组分对胰脂肪酶的抑制作用测定 参考苏建辉[12]方法并略加修改,对胰脂肪酶的活性作用进行测定。

取250 mL三角瓶数个,每瓶加入5 mL 0.025 mol/L且pH=7.5的磷酸缓冲液1 mL橄榄油作为底物,置于40 ℃水浴保温5 min,然后加入2 mg/mL的胰脂肪酶溶液1 mL(空白不加),反应15 min后立即加95%的乙醇终止反应,加1%的酚酞2～3滴,用0.025 mol/L的氢氧化钠溶液滴定至淡红色,且30 s内不变色即为滴定终点,读取氢氧化钠溶液消耗量并计算抑制率。

胰脂肪酶抑制率(%)=100×(A空白管-A空白对照管-(A样品管-A样品对照管))/(A空白管-A空白对照管)

式(4)

1.2.6 蛋白组分清除胆固醇能力测定 参考李妍等[13]方法降胆固醇作用试验方法,并略加修改进行降胆固醇作用测定。

准确吸取0.8 mg/mL标准胆固醇工作液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL试管中,然后用冰乙酸补足4 mL,接着沿着试管壁加入0.01 mol/L的硫酸亚铁溶液2 mL,摇匀静置60 min后,在560 nm处测定吸光度值。以胆固醇含量为横坐标,吸光度值为纵坐标制作标准曲线。

称取0.1 g冷冻干燥的蛋白质样品,溶解并定容100 mL,吸取1 mL于干净的25 mL试管中,然后加入0.8 mg/mL的标准胆固醇溶液1 mL,冰乙酸3 mL,0.01 mol/mL的硫酸亚铁溶液2 mL,摇匀静置60 min后在560 nm处测定吸光度值。以加入胆固醇浓度减去反应后胆固醇浓度即为清除的胆固醇浓度,计算清除的胆固醇百分数。

1.2.7 蛋白组分对胆固醇酯酶的抑制活性测定 参考苏建辉等[14]方法,略加修改,对胆固醇酯酶抑制活性作用进行测定。

按表1加样溶液和体积于25 mL的干净试管中,最后加入胰胆固醇酯酶溶液1 mL启动反应,30 min后在405 nm处测吸光度值,计算胆固醇酯酶抑制率。

表1 胆固醇酯酶抑制作用测定加样表(mL)Table 1 Samples table for cholesterol esterase inhibition test(mL)

胆固醇酯酶抑制率(%)=100×(A空白管-A空白对照管-(A样品管-A样品对照管))/(A空白管-A空白对照管)

式(5)

1.3 统计分析

所述所有实验重复至少3次,结果以多次重复平均值表示。

2 结果与分析

2.1 虾粉样品中蛋白质含量

以结晶牛血清白蛋白为标准,福林酚法测定标准曲线线性方程为y=0.2846x+0.0871,R2=0.9954,相关性好。凡纳滨对虾富含蛋白质,本实验中对虾蛋白质含量为18.40%,与张高静等[15]测试值相当,但低于彭永兴等[16]测试值。本实验蛋白检测以牛血清白蛋白为标准、福林酚方法检测,张高静、彭永兴则采用国标方法检测,数值差异原因可能与检测方法、来源地有关。凡纳滨对虾蛋白质含量高于鲤鱼、武昌鱼、草鱼、罗非鱼、黄颡鱼、匙吻鲟等,与太阳鱼、鳙鱼、乌鳢、鲇鱼相当,而低于鲫鱼、鲈鱼,从不同目来看,高于鲤形目、鲶形目、鲟形目,低于鲈形目[17]。王煜坤等[18]研究测定的罗非鱼蛋白含量显著高于凡纳滨对虾,而其他研究者测定含量在15.38%～18.01%间,可能与检测品种不同有关[19]。

2.2 不同等电点分离的虾蛋白含量

由于蛋白等电点不同,调整蛋白溶液pH,不同等电点的蛋白可以沉淀分离出来,不同等电点蛋白含量见图1。等电点PI<7的蛋白质为酸性蛋白,凡纳滨对虾中酸性蛋白含量比例最高的是pH10组分,高达87.3 mg/g,其他组分含量存在差异,但差异不大,酸性蛋白总量为474.5 mg/g;于最佳碱溶浓度pH10溶解对虾蛋白后,依次调整上清液酸碱度为pH3、pH4、pH5、pH6、pH7,分离得蛋白分别为pH3、pH4、pH5、pH6、pH7组分,该部分蛋白PI≥7,为碱性蛋白质,含量最高的为pH5组分,含量高达91.1 mg/g,而其他组分含量不等,各个组分蛋白总量为285.7 mg/g,总蛋白以酸性蛋白质为主。对中国对虾[20]和凡纳滨对虾[21]蛋白的研究发现,两种对虾蛋白的酸碱氨基酸含量相差幅度不同,但谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸比精氨酸、组氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸含量高,暗示对虾蛋白中酸性蛋白含量会比碱性蛋白含量高,本实验结果与之相符。

图1 不同等电点的凡纳滨对虾蛋白质含量Fig.1 Protein content of Penaeus vannameiat different isoelectric points

2.3 蛋白组分对胆酸盐吸附能力

以考来烯胺为横坐标、吸附率为纵坐标得考来烯胺吸附牛磺胆酸钠回归方程y=0.4178x+0.0104,R2值为0.9976;考来烯胺吸附甘氨胆酸钠回归方程为y=0.357x+0.1109,R2值为0.9981;考来烯胺吸附脱氧胆酸钠回归方程y=0.416x+0.0691,R2值为0.9488。

图2表明,不同的凡纳滨对虾蛋白组分(pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10)相对于考来烯胺对牛磺胆酸钠的吸附能力不等,不同组分对牛磺胆酸钠的吸附率在45%～86%间,以pH4、pH6、pH9较高,超过了85%,pH6的吸附率最高为91.3%,而pH10吸附率仅45%,作用不大。

图2 蛋白组分对牛磺胆酸钠吸附作用Fig.2 Adsorption of sodium taurincholate by protein samples

如图3所示,蛋白组分对甘氨胆酸钠吸附能力差别大,pH4、pH8、pH9组分吸附作用较小,分别为4%、9%和16%,pH7、pH10有一定的吸附作用,而pH5、pH6具有较强的吸附作用,其中对甘氨胆酸钠吸附能力最强的是pH6,为75.1%,具有较好的吸附甘氨胆酸钠能力。

图3 蛋白组分对甘氨胆酸钠吸附作用Fig.3 Adsorption of sodium glycate by protein samples

对脱氧胆酸钠吸附能力较好的是pH4(63%)、pH6(52%),具有一定的应用价值。而其他组分pH5(43%)、pH7(38%)、pH10(37%)也具有一定的吸附作用,但吸附作用较弱,而pH8(20%)、pH9(21%)对脱氧胆酸钠的吸附作用很弱。

胆汁酸是胆固醇的代谢物,增加胆汁酸分泌可以降低胆固醇水平[22]。胆汁酸具有亲水基团和疏水基团,疏水基团可以与蛋白质的疏水部分结合[23],疏水性决定其结合力大小[24]。一旦胆汁酸与蛋白质结合,被小肠重吸收机率降低,促进胆固醇向生成胆汁酸方向进行,排出体外,从而降低体内胆固醇含量。利用疏水性氨基酸容易与胆酸盐疏水基团结合的特点,设计体外试验,评价蛋白质或者多肽的清除胆固醇能力。

图4 蛋白组分对脱氧胆酸钠吸附作用Fig.4 Absorption of sodium deoxycholate by protein samples

对虾蛋白按照酸碱性分离成多个组分后,其酸碱性与胆酸盐的结合能力并没有表现出相关性。羽扇豆蛋白对胆酸盐的结合虽然没有选择性,但是酸溶性蛋白与牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合力比酸不溶性蛋白大[25]。其原因可能与胆酸盐-蛋白结合力、氨基酸的疏水性相关,氨基酸的疏水性能够促进与胆汁酸的结合[25];胆酸盐-蛋白结合力也与Arg/Lys比值密切相关,高Arg/Lys对胆酸盐的结合力更强[26],但是这种结合能力可能还包括蛋白肽长度贡献在内[27]。

对虾蛋白对牛磺胆酸钠的吸附作用相对较好,对甘氨胆酸钠和脱氧胆酸钠的吸附能力各异,与某些植物蛋白容易结合甘氨胆酸钠和脱氧胆酸钠、难结合牛磺胆酸钠有差异[28]。其原因可能与对虾蛋白中某些氨基酸比例与结合能力相关,对虾蛋白中Arg/Lys比值比较大[21],有利于与胆酸盐的结合。

2.4 蛋白组分对胰脂肪酶的抑制作用

如图5所示，分离蛋白组分pH6、pH7对胰脂肪酶活性具有较好的抑制作用,前者抑制率为60.1%、后者抑制率76.8%。胰脂肪酶主要在小肠内发挥作用,分解甘油三酯为甘油和脂肪酸,利于脂肪在小肠中被吸收。能量代谢性疾病常与脂肪代谢有关系,当出现高脂血症时,胰脂肪酶被当作治疗靶标,通过抑制胰脂肪酶的活性调整脂肪代谢,从而改善高脂血症状。胰脂肪酶催化活性中心并不暴露在外,而是被疏水基团组成的表面层隐藏[29]。当胰脂肪酶与底物接触时,通过电子分布的改变诱导胰脂肪酶三维结构改变,使活性中心暴露而出,与底物结合发生催化反应。分离蛋白pH6、pH7能够抑制胰蛋白酶活性,说明pH6、pH7的化学结构能够阻止电子改变,或者使催化活性中心处于氨基酸基团的保护,使其无法与外界物质接触。

图5 蛋白组分对胰脂肪酶抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of protein samples on pancreatic lipase

2.5 蛋白组分对胆固醇的清除效果

根据胆固醇对吸光度的关系拟合得标准曲线为y=0.4871x+0.0299,R2=0.9968。测定蛋白组分对胆固醇的结合量,从而计算清除作用,评估凡纳滨对虾蛋白组分清除胆固醇效果。

图6 蛋白组分对胆固醇清除作用Fig.6 Cholesterol scavenging effect of protein samples

胆固醇不溶于水,但易与疏水基团结合,当其与蛋白质中的疏水基团结合后,阻碍了胆固醇在小肠中的分解和吸收,使胆固醇停留在小肠中,随着食物残渣排出。对虾蛋白各组分蛋白对胆固醇均有较好的吸附作用,吸附作用相差不大,吸附率在67.3%～83.9%之间。其中pH9对胆固醇的吸附率最高为83.9%,pH7对胆固醇的吸附率最低为67.3%。蛋白质对胆固醇的吸附率可能与对虾蛋白氨基酸组成种类和含量有关,苯丙氨酸残基等疏水性强,则对胆固醇亲和能力好,吸附率大;色氨酸残基等疏水性弱,与胆固醇亲和力差,吸附率低[30]。

2.6 蛋白组分对胆固醇酯酶的抑制作用

对虾蛋白各组分对胆固醇酯酶的抑制率不同,从pH4的23%到pH10的83%,总体上呈现增加趋势。随着等电点数值增加,即酸性氨基酸数目增加,其对胆固醇酯酶的抑制作用增加。胆固醇酯酶分子组成富含谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸等氨基酸,谷氨酸、天冬氨酸为酸性氨基酸,其他三种为中性氨基酸,从总体看酶分子呈酸性[31]。蛋白与胆固醇酯酶之间物理作用力有酸碱离子间作用力、羧基间形成的氢键作用力,对虾蛋白酸性越大,对胆固醇酯酶抵制率越高,可能是对虾蛋白的酸性氨基酸与胆固醇分子中的酸性氨基酸的羧基形成氢键所致。

图7 蛋白组分对胆固醇酯酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of proteinsamples on cholesterol esterase

蛋白质经过胃、小肠消化后水解为多肽,可能在体内发挥抗氧化、降血压功能[32],目前研究对象多数以水解多肽为主,对于阐明蛋白质的生理功能机制具有重要作用。但实际上,蛋白质并不能全部水解为氨基酸,大鼠对饲料添加的牛肉、鱼蛋白消化利用率大约为80%[33],老人在餐后6 h内,碎牛肉、牛排消化利用率分别为61%和49%[34]。蛋白质经胃、胰酶催化水解后转变为多肽,发挥生理活性的主要原因是氨基酸种类的序列,水解后的多肽具有活性,说明未水解前的蛋白质具有该生理活性的氨基酸序列,定向酶解或者随机水解都有可能得到活性多肽,利用蛋白作为研究对象在一定程度上能够反映蛋白质的生理活性,作为大规模筛选蛋白活性具有较大优势。

3 结论

体外研究模型针对不同降脂机制进行,降甘油三酯机制主要从抑制胰脂肪酶、胆固醇酯酶活性角度进行研究,凡纳滨对虾蛋白pH6、pH7等组分具有较好的抑制胰脂肪酶作用,适合制备适于血浆甘油三酯水平偏高人群服用产品;胆酸盐吸附、胆固醇清除、胆碱酯酶活性抑制等主要用于研究降胆固醇作用,pH4、pH6、pH8、pH9等组分具有较好的降胆固醇作用;综合考虑,pH6组分降甘油三酯、降胆固醇表现较好,是降脂最佳组分。但是从营养方面考虑,对虾蛋白是一种优质蛋白资源,可以为人体提供优质蛋白和必需氨基酸,在进行对虾蛋白降脂产品开发时如必要可以另外考虑蛋白质的使用。