阿魏酸酯酶及其产生菌株的功能特性及应用研究

杨晶晶，曹阳

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

阿 魏 酸 酯 酶（Ferulic acid esterase，FAE，EC 3.1.1.73）又名肉桂酸酯酶、肉桂酸水解酶，属于羧酸酯酶亚类。1987年，MacKenzie等[1]首次在橄榄色链霉菌中发现阿魏酸酯酶。于1991年被成功分离纯化，并研究了其理化性质[2]。1990~2000年，关于阿魏酸酯酶文献总量大约有240篇，而2001~2008年大约就有420篇，其中大多数是真菌产生的阿魏酸酯酶[3]。

产阿魏酸酯酶菌株在自然界中分布广泛。桑姝丽[4]从海水中采用平板透明圈法分离到一株具有阿魏酸酯酶活性的菌株，经一系列鉴定推测为嗜甲基菌科，这是此菌株首次被发现具有阿魏酸酯酶活性。刘小梅等[5]在富含植物纤维的腐土样中筛选出产阿魏酸酯酶菌株，经鉴定为谷子弯孢菌。李玉霞等[6]采用平板法，从热带牧草青贮饲料中筛选出产阿魏酸酯酶活性较强的乳酸菌。李翠翠等[7]从黄酒中分离出一株高产阿魏酸酯酶的枝状枝孢霉菌，结果表明，该菌株可在黄酒酿造中发挥积极作用。产阿魏酸酯酶菌株也可从人和动物的肠道、反刍动物瘤胃中分离得到，但大部分为厌氧微生物，分离培养较为困难，不能满足规模生产的需求[8]。虽然大多数微生物均能产生阿魏酸酯酶，但目前阿魏酸酯酶工业化生产的来源主要为真菌[9]。随着工业化应用阿魏酸酯酶不断的扩大范围，更多的研究者致力于寻求能够产生阿魏酸酯酶的优良菌株。

自2020年7月1日起，我国已全面禁止在畜禽饲料中添加抗生素，因此探究和开发抗生素替代物是当前饲料和养殖行业的研究焦点[10]。阿魏酸酯酶作为添加剂添加到饲料中有望代替抗生素的部分功效。阿魏酸（Ferulic acid，FA）是阿魏酸酯酶通过水解酯键释放出来的，它是天然的抗氧化剂，属于植物细胞壁中一种酚酸，在机体内可起到降血脂、抗血栓、消炎抗菌等多种功效[3]。阿魏酸酯酶也是降解木质纤维的关键酶之一[11]，它能使饲料中木质纤维素的结构疏松、加快植物细胞壁的降解速度，达到增强动物对饲料消化功能的目的[12]，这对提高饲料利用率具有重要意义。

1 产阿魏酸酯酶菌株及其产酶的种类

目前已知的产阿魏酸酯酶菌株包括细菌、真菌、放线菌，且大部分是从真菌中分离出来的[9]。细菌包括乳酸杆菌属（植物乳杆菌、布氏乳酸菌、嗜酸乳杆菌、约氏乳杆菌，均为杆菌）[13]、荧光假单胞菌、热纤梭菌、伯克霍尔德氏菌属[14]等；真菌包括曲霉属（黄曲霉、米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉）等[15]；放线菌中主要为链霉菌，除虫链霉菌等均可产生阿魏酸酯酶[16]。

根据阿魏酸酯酶蛋白质一级结构的同一性以及酶作用底物的类型，可将其分为A、B、C、D四类[17-18]。A型阿魏酸酯酶底物是含甲氧基的物质，如芥子酸，是一种有刺激气味的黄褐色粉末，对水体容易造成污染。除了具有A型阿魏酸酯酶的功能，B型阿魏酸酯酶还能催化香豆酸和咖啡酸等物质。C型阿魏酸酯酶的一级蛋白序列类似于绿原酸酯酶、鞣酸酯酶的氨基酸序列。D型阿魏酸酯酶含有一种能水解植物细胞壁中酯键的荧光假单胞菌纤维素乙酰酯酶[18]。到目前为止，4种类型的阿魏酸酯酶已经从黑曲霉中被分离鉴定出来[19]。此外，Udatha等[20]基于分类和机器学习算法的描述符，将阿魏酸酯酶分成12个家族。这种新型分类系统和传统的分类并不矛盾，它极大扩展了对产阿魏酸酯酶菌株分类领域的认识，以使人们能够更为系统地了解产阿魏酸酯酶菌株的作用方式。

2 不同培养条件对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活性的影响

2.1 温度对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

温度对菌株的生长以及酶活性有很大的影响。过高或过低的温度都不利于菌株的生长及产酶，甚至使酶失活[21-23]。约氏乳酸杆菌菌株的产酶最适温度为30℃。在此温度下，酶活力高、稳定性好，当温度低于20℃或高于40℃时，酶活均较低，且超过40℃后酶活下降较快[24]。嗜热真菌菌株产酶的最适温度为55℃，此时酶具有较好的稳定性[25]。溜曲霉菌株产酶的最适温度为32℃，温度高时，菌体生长快，但容易老化，致使菌体活力维持时间较短[26]。

2.2 pH对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

不同来源的菌株产生的阿魏酸酯酶pH存在着一定的差异。荷斯坦阉牛瘤胃液中的阿魏酸酯酶的最适pH为9.0[25]；大肠杆菌的阿魏酸酯酶MhpC的最适pH为7.0[27]。嗜甲基菌科菌株的最适生长pH为7.0，且pH在6.0~9.0时有较好的稳定性[4]。溜曲霉菌株的生长和产酶最适pH分别为5.0和6.0[26]。伯克霍尔德氏菌属菌株的最适产酶pH为6.5，且此时酶活最大，而最适生长pH为5.5，由此可见菌株的最适pH未必是最适产酶pH[14，28]。

2.3 金属离子对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

张雷等[16]研究得出Mg2+、Mn2+可促进阿魏酸酯酶的活性，K+、Ca2+、Fe2+、Cu2+对该酶有一定的抑制作用，Zn2+对该酶有显著的抑制作用。而K+、Na+、Ca2+对嗜热真菌产生的阿魏酸酯酶活性有显著的促进作用，Fe3+和Zn2+对该酶有轻微的抑制作用，Cu2+和Mn2+对该酶的抑制作用更为显著[25]。深绿木霉产阿魏酸酯酶的活性可被Mg2+和Ca2+等激活，Pb2+、Hg2+等重金属离子几乎可以完全抑制该酶的活性[29]。

2.4 碳源对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

溜曲霉菌株产生的阿魏酸酯酶能在葡萄糖、乳糖、甘油和蔗糖为碳源的培养基中生长，但在蔗糖中繁殖最好，而在乳糖中菌落数量最低[30]。菌株在上述碳源中基本不产生阿魏酸酯酶，而且酶活很小，主要因为随着糖的不断分解，分解代谢物阻碍菌体产生阿魏酸酯酶[31]。而许锡凯等[32]发现好食脉孢菌菌株在以葡萄糖为碳源时阿魏酸酯酶含量最多且酶活最大。

2.5 氮源对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

溜曲霉菌株产生的阿魏酸酯酶能在尿素、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、酵母浸提物为氮源的培养基中生长，该菌株在蛋白胨、酵母提取物培养基中生长良好，但在尿素中生长较差[26]。好食脉孢菌菌株在以尿素为氮源的培养基中，生长良好且产酶最多[32]。由于有机氮源富含蛋白质、游离的氨基酸、少量的糖类、脂肪以及生长因子等，微生物能在此培养基中旺盛生长[33]。

2.6 接种量对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

接种量对产阿魏酸酯酶菌株的生长影响较小，接种量少会延迟菌株的产酶时间，接种量多时菌体很快达到稳定期，但对营养的利用和代谢废物的产生也快，导致衰亡期较快到来[34-35]。接种量对产酶量有较大的影响，接种量太少或太多都会使产酶量减少，黑曲霉菌株最适接种量为1%[36]。溜曲霉菌株最适接种量为2.5%[26]。而康超等[37]研究发现黄曲霉菌株接种量为4%时阿魏酸酯酶酶活最高。接种量较少时，菌体生长缓慢且产酶量低。当接种量过多时，由于菌体生长过快，导致培养基中营养物质明显不足，从而影响菌体的生长及产酶[23]。

2.7 转速对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

溶解氧在一定范围内随转速的增加而增多，有利于菌体的生长以及提高产酶量。黄曲霉菌株在转速为200 r·min-1时产阿魏酸酯酶最多，酶活最高[37]，但转速过高之后，溶解氧急剧升高，同时产生大量代谢物，影响菌体生长，产酶量也就降低[4]。

2.8 发酵时间对产阿魏酸酯酶菌株生长及其酶活的影响

菌体数量随着发酵时间的延长而增多，当数量较多时有利于产酶量的提高。溜曲霉菌株在48 h时菌体量达到最多且酶活在96 h时达到最大[26]。黄曲霉菌株在84 h时菌体量及酶活达到最高，然后又因菌体数量过多，引起培养基中氧气和营养物质供应不足，最终导致菌体数量明显下降[38-40]。

3 产阿魏酸酯酶菌株的培养特性及菌体形态特征

产阿魏酸酯酶的黄曲霉菌株，它有一个疏松的放射状分生孢子头和一个近球形的顶囊，在小梗上链状着生，周围有呈球形的小突起[37]。在固体培养基上，嗜甲基菌科菌株形成表面粗糙干燥，边缘不规则的白色菌落，可延伸到培养基内部，显微镜下观察到这些细胞呈球形，革兰氏阴性菌[4]。伯克霍尔德氏菌属在LB固体培养基上可形成形态为淡黄色、规则椭圆形、表面湿润光滑、不透明的菌落，革兰氏阴性菌，菌体杆状、有鞭毛、无芽孢[14]。在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，溜曲霉菌株形成表面凹凸不平的菌落，菌丝铺成棉毡状，有放射状皱褶，呈螺纹状，菌丝初期为白色，随培养时间的延长颜色逐渐为黑色，菌丝因其营养菌丝扎根于培养基内部而不易挑起，孢子弯曲如新月并逐步膨胀[26]。

4 阿魏酸酯酶水解产物的功能

阿魏酸酯酶是羧酸酯酶的一个亚类，可通过水解木质素与多糖、多糖与多糖之间的共价键形成阿魏酸，阿魏酸是存在于细胞壁中的酚酸，在甘蔗、竹子、甜菜、小麦等植物中含量最为丰富[11]。阿魏酸与细胞壁中木质素和半纤维素通过酯键和醚键连接，形成致密的网状结构[41]。利用阿魏酸酯酶切断相交联的酯键，破坏细胞的网状结构，使木质纤维素结构变得疏松，其他水解酶类更容易作用于底物中心，从而可达到有效降解利用的目的。阿魏酸具有降血脂、抗氧化、抗血栓、防治冠心病、防癌、消炎抗菌、清理身体内含有的自由基以及抗突变等医疗效果[3，42]，在养殖业应用可达到预防畜禽某些疾病，增强机体的免疫力的作用。目前，工业生产阿魏酸可采用的方法包括从植物中直接提取法、化学合成法、生物酶解法和碱解法等。其中，以阿魏酸酯酶为主的生物酶解法，因其所需原材料主要来自各种农作物副产品如麦麸、甜菜渣、玉米等，生产成本低廉、反应迅速、生产过程中污染轻微、产品较为安全等优势而受到广泛关注[25]。

5 阿魏酸酯酶的结构与作用机理

近些年来，人们对黑曲霉的A型阿魏酸酯酶（AnFaeA）的晶体结构进行了广泛的研究，Hermoso等[43]于2004年首次解析了该结构，证实该酶是一种典型的α/β水解酶结构，空间上是一个结构紧凑的球形蛋白（图1a），整个拓扑结构由7个α螺旋，9个β折叠，2个β小片段折叠区构成（图1b）。Prates等[44]的研究发现，来源不同菌株产生的阿魏酸酯酶在结构上虽然有所差异，但均为球蛋白结构，活性中心是以氨基酸Ser133-His194-Asp247的三联体结构（图2）。活性位点是丝氨酸Gly-X-Ser-X-Gly的保守区域，也是脂肪酶以及酯酶的保守域。从三级结构来看，构成供小分子进入的“入口”为天冬氨酸残基、组氨酸残基和丝氨酸残基，这是完成酯键水解的关键结构。第136~176位氨基酸残基形成的结构类似“盖子”，该结构内部疏水性大小和周围氨基酸残基极性的大小可能会影响阿魏酸酯酶的活性以及底物选择性[13]。在催化反应过程中，起催化作用的组氨酸结合天冬氨酸残基，阿魏酸酯酶的丝氨酸活性中心结合底物中的阿魏酸残基，形成一个稳定的四面体过渡态，酯键被活性中心催化打开，形成酰基-酶的复合物，再以亲核形式攻击四面体中间物，打开酯键并释放出游离的阿魏酸[45]（图3）。

图1 阿魏酸酯酶AnFaeA的结构[43]Fig.1 The structure of ferulic acid esterase AnFaeA

图2 阿魏酸酯酶的活性中心[44]Fig.2 The active center of ferulic acid esterase

图3 阿魏酸酯酶的作用机理[45]Fig.3 The mechanism of ferulic acid esterase

6 阿魏酸酯酶的应用

6.1 粮食副产物加工阿魏酸

农作物在粮食加工时会大量产生副产品，如麦麸、米糠、玉米麸、啤酒糟等，其细胞壁富含的阿魏酸结合木质素、纤维素和半纤维素等形成酯类物质，导致无法发挥生物学功能[24]。传统工业中，细胞壁中的阿魏酸是用碱法提取的，但高浓度的碱会改变植物细胞壁中某些成分以及容易造成化学残留等影响。目前，主要是利用阿魏酸酯酶提取阿魏酸的方法。植物细胞壁中的游离阿魏酸能被阿魏酸酯酶释放出来，此方法相对温和，具有特异性高、反应速度快以及对环境友好等优点，已被大家广泛重视[5]。

6.2 生物法生产酒精

阿魏酸酯酶被认为是生成生物乙醇等产品时辅助木质纤维素水解所必需的酶。将其与氧化酶和水解酶结合使用，改善植物材料的分解，提高可发酵碳水化合物的利用率[46]，在发酵酒精时，添加适量的阿魏酸酯酶提高其产率，还能去除异味并提高酒精的香气，通过发酵水解富含半纤维素的副产物可提高乙醇产量，应用于大规模生产[24]。

6.3 在食品及医药领域的应用

阿魏酸酯酶通过水解酯键从植物细胞壁释放游离的阿魏酸，阿魏酸具有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗糖尿病以及清除自由基等功效，是保护神经和治疗心脑血管疾病等药品的原料，阿魏酸还具有功能性因子等作用，可利用这一特性开发成功能性食品。阿魏酸也可作为VC和VE的载体，具有很强的亲脂性，能更好地渗入角质层中[47-49]。在生产环节，阿魏酸酯酶产生的阿魏酸可作为前体合成天然香兰素，具有无毒、无害、安全性能高等特点，值得信赖[50]。

6.4 在造纸工业中的应用

决定木浆能否生产出高品质纸张的关键是白度。传统方法是采用除去木质素和氯化物化学漂白，这种方法所使用的化学品价格昂贵，影响水质，容易造成环境污染[5]。而利用阿魏酸酯酶的生物学方法进行漂白，此过程中不仅能增加纸张亮度，降低制浆废水的化学需氧量值以及能耗，还能减少对环境造成的污染[51]。

6.5 在饲料工业中的应用

在饲料中滥用抗生素会损害动物免疫细胞的功能、产生耐药性菌株、药物残留以及环境污染等危害，威胁着人类的健康[10]。阿魏酸酯酶有望取代部分抗生素作为饲料添加剂，促进畜禽健康生长。畜禽养殖业已逐步向开发安全、无公害的抗生素替代品发展[52]。此外，动物饲料的重要指标之一是纤维消化率。消化不良会造成饲料资源部分浪费，不能被机体完全吸收利用，从而抑制动物机体生长[11]。因此，在饲料中适当添加阿魏酸酯酶可达到加速降解植物细胞壁的效果，使饲料结构变得疏松，从而提高植物营养素的纤维消化以及动物对饲料的消化程度，促进动物机体生长，减少免疫应激[33]。

7 展望

阿魏酸酯酶具有广泛的应用前景，目前已被应用于现代生物技术改良产阿魏酸酯酶菌株的基因中。在已有研究的基础上，找出生产过程中各工序的关键点，对工艺参数进行分析、构建、优化和创新，使阿魏酸在工业生产上得到充分的应用[11]。产阿魏酸酯酶菌株在生物加工、食品、医药、造纸、饲料等领域有巨大的应用潜力，这些应用领域需要不同类型的阿魏酸酯酶。因此，获得适应性更广、生产能力更强、生产应用规模更大的阿魏酸酯酶菌株是今后研究的方向和重点。目前，距离实际的工业化生产还有很长的路要走，仍然需要对其进行更深的研究。