HUVEC-EVs通过JAK2/STAT3通路促进乳腺癌细胞增殖和迁移

陈宇斐， 周小荷， 李涛， 王超， 刘子瑶， 胡玉， 曹杨， 胡嘉波， 孙晓春

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

血管内皮细胞与肿瘤细胞通过细胞间直接接触作用或自分泌、旁分泌生物因子，影响彼此发生发展[1]。胞外囊泡是直径为30～1 000 nm的膜状纳米囊泡，由多种细胞类型分泌到细胞外环境中，是肿瘤微环境中细胞间交流的主要组分[2]。研究表明，胞外囊泡这种细胞通讯方式在肿瘤的发生发展中起作用[3]。以往关于内皮细胞胞外囊泡的研究主要集中在对动脉粥样硬化等心血管疾病的调控作用中[4]，但也有研究发现内皮细胞来源的胞外囊泡参与调节其他内皮细胞的血管生成[5-6]和平滑肌细胞的动脉粥样硬化保护。此外，血管内皮细胞胞外囊泡参与多种类型肿瘤的进展过程，如鼻窦肠型腺癌、非小细胞型肺癌[7]。内皮细胞可能通过胞外囊泡方式释放血管生成素-2，从而调控肿瘤生长[8]。目前关于内皮细胞的胞外囊泡对乳腺癌细胞的作用尚不完全清楚。本研究拟以MDA-MB-231和MCF-7细胞为研究对象，探讨人脐静脉内皮细胞胞外囊泡(human umbilical vein endothelial cell-derived extracellular vesicles, HUVEC-EVs)对人乳腺癌细胞增殖和迁移的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂及仪器

人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞系和人脐静脉内皮细胞系(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。H-DMEM、DMEM-F12、胎牛血清、胰酶均为美国Gibco公司产品；MTT试剂(美国Amrgsco公司)；二甲基亚砜溶液(上海生工公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；Matrigel胶(美国BD公司)；链霉素、青霉素、蛋白质裂解液RIPA和BCA蛋白浓度检测试剂盒均购自上海碧云天公司；兔抗人JAK2抗体、兔抗人p-STAT3抗体、兔抗人GAPDH抗体、鼠抗人STAT3抗体均为美国CST公司产品；兔抗人p-JAK2抗体(美国Abcam公司)；HRP标记羊抗兔IgG、HRP标记羊抗鼠IgG(上海爱必信公司)。二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪(美国Biotek公司)；化学发光凝胶成像分析系统(美国GE公司)。

1.2 细胞培养

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的H-DMEM，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞。并用含10%胎牛血清、100 U/mL 青、链霉素的DMEM-F12，于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中培养HUVEC，用于收集培养上清液及胞外囊泡。取对数生长期的MDA-MB-231和MCF-7细胞用于后续实验。

1.3 胞外囊泡的提取

HUVEC生长至90%左右融合度时，用无血清培养基孵育24 h，收集上清液；4℃以2 000×g离心20 min，去除细胞和碎片；然后于4℃以100 000×g超速离心1 h；将沉淀重悬于PBS中，以100 000×g超离心1 h；胞外囊泡的浓度按照BCA蛋白定量试剂盒说明书操作进行定量。

1.4 MTT实验检测乳腺癌细胞增殖能力

MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞分别用含0、10、20或40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM处理24 h；收集细胞，以2×103个/孔细胞密度接种于96孔板，每组设5个复孔，并设置4个时间点(0、24、48和72 h)。分别按照设置时间点，在每孔中加入20 μL MTT试剂(5 mg/mL)，37 ℃培养4 h；每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，置于摇床上低速震荡10 min，以确保结晶充分溶解。使用酶标仪测定490 nm波长处各孔光密度值。

1.5 平板克隆实验检测乳腺癌细胞克隆能力

MDA-MB-231和MCF-7细胞分别用含有0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM处理24 h；收集细胞，计数，以500个/孔细胞密度接种于6孔板，于37℃、5%CO2孵箱内培养10 d；4%多聚甲醛固定细胞30 min；PBS洗2遍；结晶紫染色15 min；PBS洗2～3遍；拍照计数并统计分析。

1.6 Transwell迁移实验检测乳腺癌细胞迁移能力

0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs分别处理MDA-MB-231和MCF-7细胞24 h；计数，以1×105/孔细胞重悬于200 μL无血清培养基中；将细胞悬液全部滴加于Transwell小室中，在下室内分别加入800 μL含10%胎牛血清的营养液，于37℃、5%CO2孵箱内培养8 h；吸干上室内液体，用棉签除去未迁移细胞，将小室移入4%多聚甲醛中固定30 min；结晶紫染色30 min；在显微镜下随机观察3个视野，并进行计数和统计。

1.7 Transwell侵袭实验检测乳腺癌细胞侵袭能力

将30 μL基质胶与90 μL预冷PBS混合，添加至Transwell小室上室中，培养箱内孵育30 min。0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs处理MDA-MB-231和MCF-7细胞24 h；计数，以1×105/孔细胞重悬于200 μL无血清培养基中；将细胞悬液全部滴加于Transwell小室中，在下室内分别加入800 μL含10%胎牛血清的营养液，放置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养30 h，后续操作同“1.6”。

1.8 划痕实验检测乳腺癌细胞迁移能力

MDA-MB-231和MCF-7细胞分别用含有0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM处理24 h；收集细胞，接种于6孔板，待细胞融合至80%左右，用200 μL移液枪头在6孔板中划3条直线，再用无血清培养液漂洗直到无漂浮的细胞为止，在显微镜下观察。并于0 h、24 h时在多个部位拍照，拍取代表性图像。最后计数0 h到24 h的划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h宽度-24 h宽度)/0 h宽度×100%。

1.9 蛋白质印迹实验检测JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达

MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞分别用含有0、10、20或40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM处理24 h；弃培养液，加入RIPA裂解液裂解细胞，全程冰上操作，提取总蛋白，并用BCA蛋白浓度检测试剂盒定量浓度。10%SDS-PAGE分离蛋白，80 V电泳30 min，然后将电压调至100 V，继续电泳1 h；以350 mA湿转90 min至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；分别加入兔抗人JAK2抗体、兔抗人p-JAK2抗体、兔抗人GAPDH抗体(内参)、鼠抗人STAT3抗体，均1 ∶1 000稀释，兔抗人p-STAT3抗体(1 ∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次15 min；HRP标记羊抗兔/羊抗鼠二抗(1 ∶5 000稀释)室温孵育2 h；TBST洗膜3次，每次15 min；ECL曝光显影，凝胶图像处理系统进行拍照。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 HUVEC-EVs促进乳腺癌细胞增殖

MTT结果显示，MDA-MB-231细胞中，与0 μg/mL HUVEC-EVs组相比，10和20 μg/mL HUVEC-EVs组48 h、72 h细胞增殖率显著增高(P<0.05)，呈一定的浓度依赖性和时间依赖性，40 μg/mL HUVEC-EVs组48 h、72 h细胞增殖率明显增高(P<0.05)，呈一定的时间依赖性，但明显低于20 μg/mL HUVEC-EVs组(P<0.05)。对于MCF-7细胞而言，与0 μg/mL HUVEC-EVs组相比，20、40 μg/mL HUVEC-EVs组24 h细胞增殖率明显增高(P<0.05)，呈一定的浓度依赖性。与0 μg/mL HUVEC-EVs相比，3种浓度处理组48 h时细胞增殖率均显著升高(P<0.05)；72 h时细胞增殖率开始下降，但仍高于0 μg/mL HUVEC-EVs组。以上结果提示，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs处理乳腺癌细胞能显著促进其增殖能力。见图1。

a：P<0.01，与同浓度0 h HUVEC-EVs组比较；b：P<0.05，与同时间点0 μg/mL HUVEC-EVs组比较；c：P<0.05，与同时间点10 μg/mL HUVEC-EVs组比较；d：P<0.05，与同时间点20 μg/mL HUVEC-EVs组比较

图1 MTT实验检测不同浓度HUVEC-EVs处理不同时间后乳腺癌细胞增殖能力

2.2 HUVEC-EVs增强乳腺癌细胞克隆形成能力

平板克隆形成实验结果显示，HUVEC-EVs处理24 h后，与0 μg/mL 组相比，MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞20和40 μg/mL HUVEC-EVs组细胞克隆形成数明显增多(P<0.05或P<0.01)，且40 μg/mL组明显高于20 μg/mL组(P<0.01)。见图2。

2.3 HUVEC-EVs增强乳腺癌细胞迁移和侵袭能力

Transwell迁移结果显示，MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞，与0 μg/mL 组相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs组细胞迁移数均明显增多(P<0.05或P<0.01)，见图3。Transwell侵袭实验结果显示，MDA-MB-231和MCF-7细胞，与0 μg/mL 组相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs组细胞侵袭数明显增多(P<0.05或P<0.01)，20、40 μg/mL HUVEC-EVs组和10 μg/mL HUVEC-EVs组间均存在统计学差异，见图4。划痕实验结果显示，MDA-MB-231和MCF-7细胞，与0 μg/mL HUVEC-EVs对照组相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs处理后的划痕愈合率明显升高(P均<0.01)。见图5。

a：P<0.05，b：P<0.01，与0 μg/mL HUVEC-EVs组比较；c：P<0.05，d：P<0.01，与10 μg/mL HUVEC-EVs组比较；e：P<0.05，f：P<0.01，与20 μg/mL HUVEC-EVs组比较

图2 平板克隆实验检测不同浓度HUVEC-EVs处理后乳腺癌细胞克隆形成能力

a：P<0.05，b：P<0.01，与0 μg/mL HUVEC-EVs组比较；c：P<0.01，与10 μg/mL HUVEC-EVs组比较；d：P<0.05，e：P<0.01，与20 μg/mL HUVEC-EVs组比较

图3 Transwell迁移实验检测不同浓度HUVEC-EVs处理后乳腺癌细胞迁移能力(×100)

a：P<0.01，与0 μg/mL HUVEC-EVs组比较；b：P<0.05，c：P<0.01，与10 μg/mL HUVEC-EVs组比较；d：P<0.01，与20 μg/mL HUVEC-EVs组比较

图4 Transwell侵袭实验检测不同浓度HUVEC-EVs处理后乳腺癌细胞侵袭能力(×100)

a：P<0.01，与0 μg/mL HUVEC-EVs组比较；b：P<0.01，与10 μg/mL HUVEC-EVs组比较；c：P<0.05，d：P<0.01，与20 μg/mL HUVEC-EVs组比较

图5 划痕实验检测不同浓度HUVEC-EVs处理后乳腺癌细胞迁移能力(×40)

2.4 HUVEC-EVs促进乳腺癌细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达

蛋白质印迹结果显示，MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞，与0 μg/mL HUVEC-EVs对照组相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs处理后p-JAK2和p-STAT3蛋白表达明显升高(P<0.05或P<0.01)，而总JAK2和STAT3蛋白水平比较，差异无统计学意义(P均>0.05)。见图6。

a：P<0.05，b：P<0.01，与0 μg/mL HUVEC-EVs组比较；c：P<0.05，d：P<0.01，与10 μg/mL HUVEC-EVs组比较；e：P<0.01，与20 μg/mL HUVEC-EVs组比较

图6 蛋白质印迹实验检测不同浓度HUVEC-EVs处理后乳腺癌细胞相关蛋白表达

3 讨论

胞外囊泡在细胞间通讯交流中起重要作用，特别是在癌症发生发展中[9]。内皮细胞源胞外囊泡通过递送内容物，从而调控靶细胞的增殖、迁移、凋亡等功能[10]。研究表明内皮细胞源胞外囊泡中miR 503可抑制CCND2和CCND3基因表达，从而抑制乳腺癌细胞增殖和转移[11]。但本研究MTT实验和平板克隆形成实验结果显示，经HUVEC-EVs处理后乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞增殖能力明显增强；在72 h，MDA-MB-231细胞增殖仍增高，但MCF-7细胞增殖数有所下降，推测该现象可能是因为在48 h时MCF-7细胞数已接近饱和，后无空间再生长而导致细胞活性逐渐下降；此外，两种乳腺癌细胞系恶性程度等都有区别，导致结果不完全一致。Transwell实验及划痕实验结果显示，HUVEC-EVs处理后，两种乳腺癌细胞迁移和侵袭能力也明显增强。除了增殖、迁移、侵袭外，HUVEC-EVs是否还参与乳腺癌细胞的其他生物学行为，如相关信号转导通路激活还有待进一步研究。

JAK2/STAT3途径是STAT3信号转导与转录激活的关键途径[12]。研究显示，在乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌等恶性肿瘤中，JAK、STAT呈异常表达和过度激活，尤其是STAT3处于持续活化状态[13]。STAT3是一种多功能蛋白，通过调节cyclin D1、Bcl-2和Bcl-xL等蛋白表达，影响细胞周期、细胞增殖和凋亡等多种生物学过程，最终控制肿瘤生长和转移[14]。研究表明，在高转移肝癌细胞系中，siRNAs特异性沉默STAT3后，细胞迁移和侵袭能力下降[15]。研究发现骨桥蛋白通过激活乳腺癌细胞JAK2/STAT3信号通路上调Bcl-2和cyclin D1表达，从而抑制细胞凋亡和促进肿瘤生长[16]。本研究结果显示，HUVEC-EVs处理后，乳腺癌细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达升高，提示HUVEC-EVs介导乳腺癌细胞磷酸化过程。

综上所述，HUVEC-EVs可能通过JAK2/STAT3通路的磷酸化来促进乳腺癌细胞增殖和迁移，该过程中涉及多个环节，是否还有其他通路参与有待进一步研究。