线粒体活性氧在心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体激活中的作用

颜骏， 张浩， 王好， 陶艾彬， 姚永伟， 张国辉， 芮涛

(江苏大学附属人民医院心内科， 江苏 镇江 212002)

临床上脓毒症并发心功能障碍的发病率高且死亡率高[1]。但是脓毒症引起心功能损伤的机制尚不清楚，也欠缺有效的针对性治疗。

有文献报道，白介素(IL)-1β与脓毒症心肌功能损伤相关[2]，IL-1β的生成和调控与炎症小体相关。炎症小体是一类存在于细胞质中的蛋白复合体，能识别细胞内病原相关分子模式(PAMPs)或损伤相关分子模式(DAMPs)等，通过介导IL-1β和IL-18的生成，调控炎症相关基因表达等方式产生各种生物学效应[3-4]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体可对多种物理、化学刺激做出反应，如活性氧(ROS)、外源性三磷酸腺苷(ATP)等[5-6]。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和caspase-1前体组成。NLRP3小体有多种活化途径，经典的为双信号途径，分为引发和激活两个阶段。引发阶段胞质内的NLRP3和IL-1β前体的合成增多，激活阶段通过活化的caspase-1进一步生成IL-1β和IL-18，发挥生物学作用[7]。

目前影响NLRP3炎症小体激活的因素尚未完全明确。我们之前的研究显示，使用脂多糖刺激6 h，可使心肌成纤维细胞内NLRP3、pro-IL-1蛋白合成增多，再使用ATP刺激30 min，可激活NLRP3炎症小体，产生IL-1β和IL-18。并通过“细胞交互作用”与高迁移率族蛋白B1联合作用，引起心肌细胞收缩功能减弱[8]。本研究使用线粒体活性氧(mtROS)靶向清除剂mito-TEMPO减少炎症小体激活阶段心肌成纤维细胞胞内mtROS的表达，探讨mtROS在心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体激活中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C57BL/6小鼠购自江苏大学实验动物中心，动物合格证号SCXK(苏)2013—0011。IL-1β鼠抗体、NLRP3兔抗体、ASC兔抗体、脂多糖、ATP(Cell Signaling Technology公司)；caspase-1鼠抗体(Novus Biologicals公司)；兔多克隆β-肌动蛋白抗体、羊抗兔IgG抗体(英国Abcam公司)；羊抗鼠IgG抗体(美国Bio-world公司)； mito-TEMPO、Hoechst 33342、胶原酶、中性蛋白酶(美国Sigma-Aldrich公司)；培养基DMEM/F12(维森特生物技术有限公司)；胎牛血清(ExCell Bio公司)；测定IL-1β的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国RδD Systems公司)；MitoSOX(美国Thermo Fisher公司)；细胞裂解液、蛋白A/G琼脂糖珠、蛋白酶抑制剂混合物、BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司)；其他试剂都为化学分析纯。

1.2 小鼠成纤维细胞的分离和培养

取3～4周雌雄不限的C57BL/6小鼠6只，以断颈法处死，于超净工作台在无菌条件下取出心脏，将心脏在冷D-Hanks液中切割为约1 mm3的组织小块后，浸没于胶原酶(0.002 g/mL)和中性蛋白酶(0.001 g/mL)中，在37 ℃、5%CO2培养箱缓慢振荡45 min，取上清液1 500 r/min离心5 min，去除上清液后加入含10%胎牛血清的DMEM到培养皿中。如此反复2～3次，收集所得细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中，3 h后去除未贴壁细胞悬液，剩余贴壁细胞每日更换培养基，显微镜下观察细胞生长状态，培养72 h可用于实验[9]。

1.3 实验分组

取培养的心肌成纤维细胞分为4组处理。引发组：加入含0.001 ng/L脂多糖的培养基处理6.5 h；激活组：先加入含0.001 ng/L脂多糖的培养基，6 h后加入3 mmol/L的 ATP，继续培养0.5 h[10]；干预组：先加入含0.001 ng/L脂多糖的培养基，5.5 h后加入25 μmol/L的mito-TEMPO[11]，0.5 h后再加入3 mmol/L的ATP，维持0.5 h；对照组：加入常规培养基6.5 h后，添加与干预组试剂等量的D-Hanks液。

1.4 MitoSOX染色观察小鼠心肌成纤维细胞mtROS表达

将处理好的各组心肌成纤维细胞去除培养基后，使用D-Hanks液洗涤3次，加入5 μmol/L的MitoSOX，37 ℃避光孵育10 min[12]，去除染液并再次清洗后，加入0.001 μg/L的Hoechst 33342染液37 ℃避光孵育10 min，去除染液并再次清洗后在荧光显微镜(Zeiss LSM880, 美国)下观察、拍照。胞质中mtROS呈红色，细胞核呈蓝色，每组观察10个细胞，通过Image J软件分析荧光强度数值后取平均值，重复3次。

1.5 蛋白质印迹法检测细胞Pro-IL-1β、ASC、NLRP3、Pro-caspase-1蛋白表达

收集4组细胞提取蛋白，取10 μL样品由10%SDS-PAGE电泳转移到PVDF膜上。5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，分别使用一抗IL-1β(1 ∶1 000)、ASC(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、caspase-1(1 ∶1 000)、β-肌动蛋白(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，二抗羊抗兔IgG抗体(1 ∶5 000)、羊抗鼠IgG抗体(1 ∶5 000)室温孵育2 h。Bio-Rad曝光仪摄像，以β-肌动蛋白作为内参，Image J软件分析灰度值。

1.6 蛋白质印迹法检测细胞上清液中IL-1β和caspase-1 p20蛋白表达

分别收集4组细胞上清液，将上清液与无水甲醇、氯仿混合，4 ℃以15 000×g离心15 min，去除上清液，加入无水甲醇800 μL，再4 ℃以15 000×g离心15 min，去除上清液后得到所需提取蛋白。所提取蛋白通过蛋白印迹法分别检测caspase-1 p20、IL-1β蛋白表达。

1.7 ELISA法检测小鼠心肌成纤维细胞上清液中IL-1β蛋白含量

将4组细胞上清液各50 μL加入微孔板室温孵育2 h，洗涤后加入100 μL酶标检测抗体室温孵育2 h，再次洗涤后加入显色剂混合物100 μL室温孵育30 min。加入终止液100 μL，30 min内使用酶标检测仪测量450 nm的光密度值，设置540 nm作为校正波长。根据标准曲线计算出各组标本中IL-1β蛋白含量。

1.8 免疫共沉淀法检测与ASC结合的NLRP3及Pro-caspase-1蛋白的表达

心肌成纤维细胞用混合有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液裂解后，15 000×g，4 ℃离心15 min，收集上清液。将蛋白A/G琼脂糖珠与上清液混合，4 ℃摇晃20 min；再以4 ℃，12 000 r/min离心15 min，所得上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。将兔抗ASC单克隆抗体(31 μg)加入到含500 μg总蛋白的上清液中，将所得混合物在4 ℃以4 000×g离心5 min，去上清液，将上样缓冲液加入到琼脂糖珠-抗原抗体复合物中。将混合物煮5 min，取上清液行SDS-PAGE并转移至PVDF膜，并用针对小鼠ASC、NLRP3和Pro-caspase-1蛋白的抗体进行蛋白质印迹。

1.9 统计分析

2 结果

2.1 各组小鼠心肌成纤维细胞mtROS比较

如图1所示，小鼠心肌成纤维细胞受脂多糖和ATP刺激后，mtROS水平较对照组明显增加(P<0.05)；使用mito-TEMPO干预后，mtROS水平较激活组明显下降(P<0.05)，但仍明显高于对照组(P<0.05)。

n=3； #：P<0.05，与对照组比较；*：P<0.05，与激活组比较图1 mitoSOX染色观察小鼠心肌成纤维细胞mtROS水平

2.2 各组心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体相关蛋白的表达

如图2所示，心肌成纤维细胞经脂多糖刺激后，细胞内NLRP3和Pro-IL-1β蛋白较对照组明显升高(P<0.05)，而Pro-caspase-1、ASC的表达无明显变化；经ATP激活和mito-TEMPO干预后，干预组中Pro-IL-1β较激活组升高(P<0.05)。

使用ATP激活NLRP3炎症小体，上清液中caspase-1 p20和IL-1β较对照组明显升高(P<0.05)，而干预组使用mito-TEMPO降低mtROS后使caspase-1 p20和IL-1β较激活组明显减少(P<0.05)。ELISA检测结果显示，激活组上清液中IL-1β含量较对照组明显升高(P<0.05)，干预组上清液中IL-1β含量较激活组明显减少(P<0.05)。见图3。

2.3 各组心肌成纤维细胞中NLRP3、Pro-caspase-1与ASC结合情况

免疫共沉淀法检测可见，经脂多糖和ATP刺激后，心肌成纤维细胞中NLRP3-ASC连接形成复合体，干预组NLRP3和ASC的结合减少。而Pro-caspase-1蛋白不受影响。见图4。

① 对照组； ② 引发组； ③ 激活组； ④ 干预组n=3； #：P<0.05，与对照组比较；*：P<0.05，与激活组比较图2 各组心肌成纤维细胞胞内NLRP3炎症小体相关蛋白的表达

① 对照组； ② 引发组； ③ 激活组； ④ 干预组n=3； #：P<0.05，与对照组比较；*：P<0.05，与激活组比较图3 各组心肌成纤维细胞上清液中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达

图4 免疫共沉淀法检测各组心肌成纤维细胞NLRP3和ASC的结合

3 讨论

IL-1β的生成增加是脓毒症引发心肌收缩力下降和脓毒症休克的重要因素[13]，IL-1β的生成、成熟、分泌受NLRP3炎症小体激活的调节[14]。我们之前的研究发现，脓毒症可导致心肌成纤维细胞中NLRP3炎症小体的激活[8, 10]，来自心肌成纤维细胞的IL-1β经心肌成纤维细胞-心肌细胞相互作用，引起脓毒症诱导的心肌细胞凋亡和心肌功能障碍。在本研究中，我们进一步发现脂多糖可引起心肌成纤维细胞中mtROS生成增加，mtROS增加又通过促进细胞内NLRP3和ASC蛋白的结合激活NLRP3炎症小体，而通过减少激活阶段的mtROS可抑制NLRP3炎症小体的激活和心肌成纤维细胞分泌IL-1β。

NLRP3炎症小体为细胞内的多蛋白平台，其激活经引发和激活两个阶段。在引发阶段，刺激因素通过NF-κB途径，增加了细胞内Pro-IL-1β和NLRP3蛋白水平，但并不会影响ASC和Pro-caspase-1的细胞内水平。而激活阶段，刺激物引发NLRP3蛋白的NACHT结构域发生自身寡聚化，从而连接蛋白ASC与Pro-caspase-1，引发相互作用。NLRP3炎症小体复合物通过切割Pro-caspase-1使其活化，活化的caspase-1再将Pro-IL-1β和Pro-IL-18切割，引起IL-1β和IL-18成熟和释放[7]。我们的研究结果表明，在脓毒症中mtROS在NLRP3炎症小体激活中起到关键作用，其通过促进NLRP3蛋白和ASC蛋白的结合引发NLRP3炎症小体的激活。而在激活阶段使用mito-TEMPO可有效降低细胞内mtROS的含量，从而可进一步抑制炎症小体的激活。

但本研究尚不能确定mtROS是通过何种方式来促进NLRP3-ASC蛋白连接，或是否存在其他途径促进心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体激活。本研究结果表明mtROS在心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体激活中起到重要作用，可能是治疗脓毒症诱发的心肌功能障碍的潜在靶点。