新型铈掺杂碳量子点的构建及其对乳腺癌细胞的杀伤作用

蔡茸， 张静静， 徐丽霞， 刘苏婉， 刘劲静， 龚爱华， 张苗苗， 杜凤移

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

近年来，碳量子点因其优异的光学和化学性质以及许多潜在的应用而受到人们的广泛关注[1-3]。目前，由于其水分散性好、化学惰性强、光稳定性强、细胞毒性低以及生物相容性好等优点，碳量子点在生物工程领域掀起了研究热潮。本课题组前期的研究证明，碳量子点在抗氧化功能[4]、CT成像功能[5]和载基因功能[6]等领域表现出巨大潜能。

光热消融(photothermal ablation, PTA)是近几年发展起来的一种新型肿瘤治疗手段，具有精确、可控、高效和不良反应少等优点[7-8]。PTA主要利用具有高效光热转换效率的材料富集在肿瘤部位，并在外部光源的照射下将光能转化为热能来杀死肿瘤细胞，从而抑制肿瘤生长[9-10]。尽管PTA在肿瘤治疗中表现出一定的效果，但尚缺乏生物相容性好、光热转化性能高的光敏剂，所以在一定程度上阻碍了其在临床上的广泛应用。有研究报道称，碳基纳米材料具有较好的光热转换性能[11-12]。鉴于此，本文旨在探索制备新型高效光热转换效率的纳米光敏剂铈掺杂的碳量子点(cerium doped carbon quantum dots, Ce-doped CDs)，及其抑制肿瘤生长的能力。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

草酸铈(上海阿拉丁试剂公司)；甘氨酸(德国biofroxx公司)；胎牛血清和DMEM(美国Hyclone公司)；CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；微波炉(广东格兰仕微波生活电器制造有限公司)；高分辨透射电子显微镜(日本东京乔尔有限公司)；荧光光谱仪(美国瓦里安公司)；全自动数码凝胶图像分析仪(南京麦高德生物科技有限公司)；808 nm激光器(北京镭志威光电技术有限公司)；热成像摄像机(东莞新泰仪器有限公司)；酶标仪(美国比奥泰克仪器公司)。

1.2 Ce-doped CDs的制备

称取0.2 g草酸铈溶解于24 mL去离子水(含4 mL浓盐酸)中，在85 ℃下持续搅拌1 h，再加入0.8 g甘氨酸，搅拌0.5 h，形成透明液体。将溶液转移到微波炉中高火加热10 min以得到碳化的黑色块状物，倒入20 mL水溶解。黑色溶液以2 000 r/min离心10 min去除沉淀，将上清液透析、冻干，得到的黑色粉末即Ce-doped CDs。

1.3 Ce-doped CDs的形貌和光学表征

采用透射电子显微镜在200 kV加速电压下观察Ce-doped CDs的形貌特征，同时，利用荧光光谱仪检测Ce-doped CDs的荧光信号。

1.4 Ce-doped CDs的光热效能

将Ce-doped CDs配成不同浓度(40、80、120、160、200 μg/mL)水溶液，在功率密度为1.0 W/cm2的808 nm近红外激光下照射各水溶液，同时，以去离子水作为对照组，另外，再用不同功率密度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 W/cm2)的808 nm近红外激光照射200 μg/mL 的Ce-doped CDs水溶液，每隔30 s记录温度变化的数值。为了探究Ce-doped CDs的光热再生性和稳定性，将200 μg/mL 水溶液置于1.0 W/cm2的808 nm近红外激光照射下进行5次加热-冷却循环。

1.5 细胞活力实验

采用CCK-8法测定不同浓度的Ce-doped CDs对细胞活力的影响。将1.5×104个MEF细胞(小鼠胚胎成纤维细胞系)和4T1细胞(人乳腺癌细胞系)分别接种于96孔板中孵育24 h，加入不同浓度的Ce-doped CDs(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL)孵育48 h，再加入CCK-8试剂，使用酶标仪测定450 nm处每孔的光密度。另外，为了检测光照对加入不同浓度Ce-doped CDs的细胞活力的影响，将不同浓度Ce-doped CDs(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL)孵育的细胞置于808 nm激光下照射5 min，24 h后加入CCK-8试剂测定光密度。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 Ce-doped CDs的形貌表征

高倍透射电子显微镜观察结果(图1A)显示，制备的Ce-doped CDs形态均一、近似颗粒状，在室温下均匀分散于水中且无明显沉淀。另外，更加高倍视野的透射电子显微镜图像显示Ce-doped CDs具有混合相结构，即同时具有非晶格和晶格两种结构，如图1B所示，线条圈出纳米颗粒，箭头所指区域能清楚地看到晶格结构。同时，Image J软件分析所制得的粒径分布曲线符合高斯正态分布，如图1C所示，该曲线显示Ce-doped CDs的平均尺寸约为(2.59±0.37) nm，符合高斯正态分布曲线。

A、B：Ce-doped CDs的高倍透射电镜图；C：Ce-doped CDs的粒径分布

图1 Ce-doped CDs的透射电镜图和粒径分布

2.2 Ce-doped CDs的光学性能

利用荧光光谱检测Ce-doped CDs的荧光性能。Ce-doped CDs的光谱图(图2A)显示荧光光谱的发射波长与激发波长有很密切的联系，虽然随着激发波长以20 nm为间隔从320 nm增加到440 nm，发射光谱从417 nm移动到505 nm，但其荧光强度在360 nm激发波长下开始增加，达到峰值后再逐渐递减。归一化发射光谱之后，如图2B可以看出，随着激发波长的增加，Ce-doped CDs的发射光谱发生了约40 nm的红移。同时，在360 nm激发波长下观察到440 nm处的最大发射(图2C)。

2.3 Ce-doped CDs的光热性能

固定近红外光功率为1.0 W/cm2，研究不同浓度Ce-doped CDs溶液的温度变化。如图3显示，溶液温度变化呈现明显的浓度依赖性。值得注意的是，Ce-doped CDs在200 μg/mL浓度下经过光照6 min即可达到55.1 ℃，通过调节Ce-doped CDs的溶质含量，使溶液的温度精确控制在20 ℃～55 ℃，而对照组在同等照射条件下温度无明显变化。

A：不同激发波长下 Ce-doped CDs的荧光光谱图；B：Ce-doped CDs的归一化荧光光谱图；C：最大激发波长下Ce-doped CDs的最大发射光谱图2 表征Ce-doped CDs的光学性能

A：不同浓度Ce-doped CDs在近红外光(808 nm)激发下的光热曲线图；B：相应的近红外热成像图图3 不同Ce-doped CDs浓度下的光热成像图

随后，固定Ce-doped CDs浓度为200 μg/mL，研究不同功率密度的近红外光对温度变化的影响。如图4所示，Ce-doped CDs的温度升高与功率密度呈正相关。

A： 不同功率密度下Ce-doped CDs在近红外光(808 nm)激发下的光热曲线图；B：相应的近红外热成像图图4 不同功率密度下的光热成像图

另外，利用激光开-关5个循环周期对Ce-doped CDs的光热重复性和稳定性进行研究。结果表明，所获得的温度变化曲线图在5个周期内相互匹配良好(图5)。以上结果说明制备的Ce-doped CDs具有非常可靠的光热转换稳定性，且光热转换效率呈现浓度和功率密度依赖性。

图5 Ce-doped CDs水溶液在5个激光开关周期内的温度变化曲线图

2.4 Ce-doped CDs的细胞活力实验

如图6A所示，MEF和4T1细胞在不同浓度的Ce-doped CDs作用下依旧显示很好的生物相容性以及低毒性，甚至在高浓度1 200 μg/mL下对细胞活力也无显著影响。与对照组相比，不同浓度Ce-doped CDs孵育过的细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。

测量近红外激光照射经Ce-doped CDs孵育过的细胞活力结果显示，随着Ce-doped CDs浓度的增加，在相同近红外激光(808 nm，1.0 W/cm2)照射下，细胞活力逐渐递减。如图6B、6C所示，无论是正常细胞MEF还是肿瘤细胞4T1，都有相同的变化趋势，值得注意的是，在其他条件均一致的情况下，4T1细胞活力下降趋势更加明显，在1 200 μg/mL浓度的Ce-doped CDs处理下，MEF细胞依旧有79%的存活率，而4T1细胞仅剩7%。这说明我们制备的Ce-doped CDs具有很好的光热转换性能，同时，由于肿瘤细胞对温度变化更加敏感，所以其光热杀伤效果更加显著。

A：Ce-doped CDs的生物相容性；B、C：808 nm(1.0 W/cm2，5 min)近红外激光下Ce-doped CDs对MEF细胞和4T1细胞的杀伤性能

图6 Ce-doped CDs的生物相容性和体外细胞近红外杀伤性能

3 讨论

本研究以草酸铈和甘氨酸为前驱物，通过微波水热碳化法合成Ce-doped CDs。其形态均一、粒径微小、生物相容性好，具有混合物相结构。Ce-doped CDs表现出与传统碳量子点类似的荧光性能，表面存在空洞结构，这使得其通过空洞进行能量储存而导致光致发光成为可能[13]。值得注意的是，Ce-doped CDs还具备优越的光热转换效率与可重复利用性。用相同功率密度(1.0 W/cm2)照射不同浓度的Ce-doped CDs水溶液，甚至最低浓度为40 μg/mL时，其光热转换效果也很显著；用不同功率密度的近红外光照射相同浓度的Ce-doped CDs水溶液，甚至是低功率密度(0.2 W/cm2)，与纯水接收最高功率密度(1.0 W/cm2)近红外光照射相比，其光热转换能力依旧很高。这不仅证明Ce-doped CDs的光热转换效率与浓度和功率密度皆呈正相关，还说明其光热转换能力突出，只需极低浓度或功率密度即可发挥作用。

更重要的是，Ce-doped CDs具有高效的近红外光热转换性能，可在808 nm波长的近红外光照射下将溶液迅速升温至55.1 ℃，从而显著抑制乳腺癌细胞的生长。关闭光热开关后可迅速恢复到室温，而再次连续加热4次，在同样的时间段内依旧能够达到之前的温度，这说明反复间断近红外照射不会影响Ce-doped CDs的光热转换效果，具有可重复利用性。而正常细胞却表现出较好的热耐受性，可显著降低光热消融对正常组织的损伤，提高对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。因此，本研究制备的Ce-doped CDs在乳腺癌的光热治疗领域表现出一定的应用潜能，将丰富和改变目前临床上抗肿瘤的治疗模式和治疗思路。