分泌型cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ对胃癌细胞增殖相关基因表达的调控

李帼瑞， 庞吉， 钱海， 吴燕， 陈永昌

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

蛋白质磷酸化是最常见的蛋白翻译后修饰之一[1]。多数蛋白质磷酸化发生在胞内，由分布在细胞内的蛋白激酶催化完成。但是，细胞外的蛋白质也有磷酸化的现象，早在1883年，就已发现细胞外蛋白质酪蛋白的磷酸化，但引起其磷酸化的蛋白激酶一直未找到[2]。直到130年后，Tagliabracci发现Fam20C作为一种分泌型蛋白激酶在起作用[2-3]。自此，分泌型蛋白激酶引起人们高度重视，陆续发现VLK、c-Src酪氨酸激酶等多种分泌型蛋白激酶[4-6]。研究发现，cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(type Ⅱ cGMP-dependent protein kinase，PKG Ⅱ)也是一种分泌型蛋白激酶[7]。但是，分泌到胞外的PKG Ⅱ对细胞的作用及机制尚不明确。 为此，本研究采用重组蛋白PKG Ⅱ在细胞外直接作用于胃癌细胞的方式来模拟分泌型蛋白的作用模式，并利用转录组测序分析进行初步筛选， 结合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹进行进一步验证，初步探索分泌型PKG Ⅱ对人胃癌HGC-27和AGS细胞株基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和试剂 人胃癌HGC-27和AGS细胞株购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清(美国Excell公司)；RPMI-1640培养液，二甲基亚砜，焦碳酸二乙酯均为美国Hyclone公司产品；F12K培养液(加拿大Wisent公司)；人谷胱甘肽转移酶(GST)-PKG Ⅱ融合蛋白(加拿大Signalchem公司)；8-pCPT-cGMP(美国Biolog公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒，qRT-PCR试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；β-巯基乙醇(美国Sigma公司)；蛋白质标准参照物(美国Thermo Fisher公司)；抗人表皮生长因子(EGF)前体多克隆抗体(美国Novus公司)；β-肌动蛋白抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP标记的羊抗兔多克隆抗体(美国Jackson公司)；ECL发光液(美国Millipore公司)。

1.1.2 主要仪器 超净工作台(苏州净化设备有限公司)；细胞培养箱，高速冷冻离心机，普通PCR仪均为美国Thermo Fisher公司产品；倒置显微镜(德国Zeiss公司)；恒温水浴锅(上海福玛实验设备有限公司)；超微量蛋白核酸分析仪(北京美林恒通仪器有限公司)；超声波细胞破碎仪(美国Emerson公司)；实时荧光定量PCR仪，蛋白电泳仪均为美国Bio-Rad公司产品；干式恒温器(北京百晶生物技术有限公司)；凝胶成像及分析系统(北京赛智公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胃癌HGC-27细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，AGS细胞培养于含10%胎牛血清的F12K培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 总RNA抽提及逆转录 采用Trizol法提取总RNA，用超微量蛋白核酸分析仪对得到的样品进行浓度及纯度鉴定。将D(260 nm)/D(280 nm)在1.8～2.0之间的样品逆转录为cDNA，立即进行后续研究或置于-20℃保存备用。

1.2.3 转录组测序分析 转录组测序广泛应用于各个物种基因差异表达的研究，现有的商业化深度测序技术中Illumina HiSeq 2000具有高输出量和低成本的优势，是目前应用最为广泛的测序平台之一[8-9]。对使用谷胱甘肽硫转移酶标签在杆状病毒Sf 9昆虫细胞中表达的重组全长人PKG Ⅱ(GST-PKG Ⅱ, 100 μg/L)处理前、后的胃癌AGS细胞株转录组进行测序：加药4 h后提取细胞中总RNA，行质量检测，采用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对浓度、纯度和完整性符合测序质量要求的样品进行转录组测序。该部分实验交由南京集思慧远生物科技有限公司完成。将整理后的转录本通过基于局部对比算法的搜索工具(BLAST)BLASTn及BLASTx程序与蛋白相邻类的聚簇(COG)、基因本体(Gene Ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、真核生物蛋白相邻类的聚簇(KOG)、Pfam、Swiss-prot和NR非冗余蛋白序列数据库等7个公共数据库对比。以FDR≤0.05、│log2(FPKMGST-PKG II组/FPKM对照组) │>1为条件筛选出表达差异≥2倍的基因，再从中筛选出部分与增殖相关的基因进行验证。

1.2.4 qRT-PCR验证重组PKG Ⅱ对筛选出的增殖相关基因mRNA水平的影响 将汇合度达70%左右的HGC-27和AGS细胞消化后接种于6孔板，分为2组：对照组和GST-PKG Ⅱ (100 μg/L)+ 8-pCPT-cGMP(250 μmol/L)组。待细胞汇合度达到70%时，换无血清培养液饥饿处理8～12 h；弃上清液，无菌PBS清洗；加入相应浓度药物处理4 h。提取总RNA，逆转录为cDNA用于qRT-PCR。PCR反应体系：2×SYBR Green Ⅰ预混试剂5 μL，前引物(5 μmol/L)0.4 μL，后引物(5 μmol/L)0.4 μL，模板1 μL，加双蒸水将体系总体积调整至10 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。用2-ΔΔCt法计算候选基因的相对表达量，实验重复3次。qRT-PCR所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白质免疫印迹检测EGF前体的表达 培养细胞，待汇合度达70%时用胰蛋白酶消化，接种于6孔板中，分为5组：对照组、GST(100 μg/L)组、GST-PKG Ⅱ(100 μg/L)组、GST+8-pCPT-cGMP(250 μmol/L)组、GST-PKG Ⅱ+8-pCPT-cGMP组。待细胞汇合度达60%～70%时,更换无胎牛血清的培养液饥饿处理8～12 h；弃培养液，PBS冲洗；加相应浓度的药物处理24 h；裂解细胞，提取总蛋白，煮沸变性后于-20 ℃保存备用。取20 μg行SDS-PAGE，70 V恒压电泳；冰上300 mA恒流120 min，将蛋白转移至PVDF膜；5%牛血清白蛋白室温封闭1 h；目的条带用以5%牛血清白蛋白1 ∶500稀释的EGF前体蛋白多克隆抗体4 ℃孵育过夜；TBST清洗3次，再分别以TBST 1 ∶10 000稀释的HRP标记的羊抗兔多克隆抗体和β-肌动蛋白抗体室温孵育目的条带和内参1 h；TBST清洗3次；ECL发光液显色、凝胶成像系统扫描成像后用Image J软件进行灰度扫描分析；实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 表达受重组PKG Ⅱ调节的基因转录组测序筛选

对GST-PKG Ⅱ处理前、后的胃癌AGS细胞株转录组进行测序，质控后分别得到24.36 Gb和27.61 Gb的数据。对拼接后的转录组进行全转录组注释，将组装后的转录本通过BLASTn及BLASTx程序与COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-prot和NR共7个公共数据库对比，分别获得7 034、16 850、10 729、13 308、18 575、18 311和20 227条同源对比信息，具体如表2所示。

共筛选出579个差异表达基因。其中，在GST-PKG Ⅱ作用下267个基因表达明显上调，312个显著下调(图1)。将所筛选出的差异表达基因与COG数据库对比，共获得93个注释信息，划分为19个功能类别：分布最多的是一般功能预测基因，达31个(R)；其次为涉及氨基酸转运与代谢的功能基因(E)，共有11个；功能涉及复制、重组与修饰(L)以及信号转导机制(T)的基因各有10个，详见图2。

表2 胃癌细胞株AGS全转录组功能注释结果

虚线以下的点无意义；虚线以上的点表示FDR≤0.05且│log2(FPKMGST-PKG II组/FPKM对照组)│>1的基因；其中，右侧虚线以右者表示在GST-PKG Ⅱ作用后表达上调，左侧虚线以左者表示表达下调

图1 差异表达基因火山图

A：RNA加工和修饰；B：染色体结构和动力学；C：能量生成与转化；D：细胞周期调控，细胞分裂，染色体分离；E：氨基酸转运与代谢；F：核酸转运与代谢；G：碳水化合物转运与代谢；H：辅酶转运与代谢；I：脂类转运与代谢；J：翻译，核糖体结构与生物发生；K：转录；L：复制，重组与修饰；M：细胞壁/细胞膜生物发生；N：细胞活性；O：翻译后修饰，蛋白质折叠，伴侣；P：无机离子转运和代谢；Q：次级代谢物生物合成，转运及代谢；R：一般功能预测；S：未知功能；T：信号转导机制；U：细胞间运输，分泌物和膜泡运动；V：防御机制；W：胞外结构；Y：核结构；Z：细胞骨架

图2 差异表达基因COG功能注释分布图

对579个差异表达基因进行GO富集分析，共获得2 749个注释。将其功能划分为细胞组分、分子功能和生物过程三大类：其中，关于生物过程的注释最多，共有1 254个；其次为细胞组分，有1 089个GO注释；分子功能有406个注释。全转录组及差异表达基因GO功能分类的详细情况见图3。

每个亚分类中左侧表示全部基因的GO功能注释数，右侧代表差异表达基因的GO功能注释数图3 GO功能分类

进一步功能分类显示，579个差异表达基因中，58个与肿瘤生物学活动密切相关，20个与神经系统功能相关，9个与心脏活动有关，具体如图4所示。根据对差异表达基因的功能注释，提示分泌型PKG Ⅱ参与细胞生长、神经系统以及心脏活动等多种生物功能调节。重点筛选出与肿瘤细胞增殖相关的9个候选基因(EGF、FGF7、MARK1、GLI1、COL6A3、DFNA5、SEPT4、DACT1、PSCA，分别编码表皮生长因子、成纤维细胞生长因子7、微管亲和调节激酶1、胶质瘤相关癌基因1、Ⅵ型胶原蛋白α3链、耳聋相关基因Gasdermin-E、Septin-4、β-环连蛋白抑制基因1、前列腺干细胞抗原)，进行后续验证及分析。

图中颜色深浅表示与对照组相比的表达差异，颜色越深表明表达差异越大；↓：表达下调的基因；*：后续重点筛选出的候选基因

图4 部分差异表达基因及其功能注释

2.2 重组PKG Ⅱ对肿瘤细胞增殖相关基因转录水平的影响

qRT-PCR结果显示，与对照组比较，在GST-PKG Ⅱ和8-pCPT-cGMP共同作用下，HGC-27和AGS细胞中FGF7和MARK1等mRNA水平比较均无明显差异(P均>0.05)；EGFmRNA水平明显降低(P<0.01)，DFNA5、DACT1、PSCA等mRNA水平明显增高(P<0.01或<0.05)，与转录组测序一致；两个细胞株中GLI1、COL6A3和SEPT4 等mRNA水平比较，差异有统计学意义，但表现出相反的趋势，表明重组PKG Ⅱ在不同胃癌细胞株中发挥的作用并不完全一致(图5)。

2.3 重组PKG Ⅱ对胃癌细胞中EGF表达的影响

如图6所示，HGC-27细胞中，与对照组及GST组相比，GST-PKG Ⅱ组、GST+cGMP组和GST-PKG Ⅱ+cGMP组EGF前体蛋白水平均明显下调(P均<0.01)，且与GST-PKG Ⅱ组相比，GST-PKG Ⅱ+cGMP组EGF前体蛋白水平下调更为明显(P<0.01)；AGS细胞中，与对照组相比，GST组、GST-PKG Ⅱ组、GST+cGMP组和GST-PKG Ⅱ+cGMP组EGF前体蛋白表达水平均明显降低(P均<0.01)，但与GST-PKG Ⅱ组相比，GST-PKG Ⅱ+cGMP组EGF前体蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。

a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较图5 增殖相关基因的mRNA水平

1：对照组；2：GST组；3：GST-PKG Ⅱ组；4：GST+8-pCPT-cGMP组；5：GST-PKG Ⅱ+8-pCPT-cGMP组；a：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.01，与GST-PKG Ⅱ组比较；c：P<0.01，与GST组比较

图6 各组EGF前体蛋白表达水平比较

3 讨论

为研究PKG Ⅱ作为分泌型蛋白激酶对肿瘤基因表达的调控作用，本研究首先通过转录组测序分析筛选出579个差异表达基因，267个基因表达显著上调，312个显著下调，涉及肿瘤生物学活动、神经系统功能和心脏功能等多个方面。这些差异表达基因中个别基因的功能也有部分重叠：其中CDON具有抑制增殖和迁移、促进肿瘤细胞凋亡的作用，同时参与神经前体细胞迁移和神经元分化的正调节，在心肌重塑中也发挥一定的作用[10-13]。为增加研究结果的可靠性，本研究采用HGC-27和AGS两个细胞株对转录组测序结果进行qRT-PCR验证，结果显示从579个差异表达基因中筛选出的9个候选基因中有4个mRNA水平的变化趋势在两个细胞株中均与转录组测序结果一致，即在重组PKG Ⅱ作用下，EGF表达下调，而DFNA5、DACT1和PSCAmRNA表达上调。由此表明，该测序结果对研究分泌型PKG Ⅱ对细胞基因表达的影响有一定的参考价值。

进一步得到验证的4个基因——EGF、DFNA5、DACT1和PSCA在肿瘤细胞增殖中均具有重要的调控作用：Akino等[14]发现，DFNA5/GSDME因异常甲基化所致的沉默在原发性胃癌中常有发生，而将外源DFNA5导入NUGC3沉默细胞可抑制新霉素抗性菌落形成，逆转胃癌细胞对化疗药物的耐药性，提示DFNA5可能在胃癌中起到生长抑制作用；Rogers等[15]发现活化的caspase-3可以裂解DFNA5/GSDME，产生靶向透化质膜的坏死性DFNA5-N末端片段，介导细胞凋亡。DACT1启动子甲基化在许多研究中均有报道，包括胃癌[16]、食管鳞状细胞癌[17]和鼻咽癌[18]等，其异常甲基化与肿瘤的发生发展及患者的不良预后密切相关[16-17]，在体内和体外试验中均表现出对胃癌的抑制作用[19]。DACT1过表达还可通过抑制KG-1α增殖、促进细胞凋亡进而抑制白血病发生和进展[20]。PSCA在前列腺癌中高表达，但在胃癌和食管癌中却几乎不表达[21]，敲除PSCA基因在体外和体内均能促进胃癌细胞增殖，体外试验中PSCA高表达可抑制胃癌AGS细胞增殖[22]。多篇文献报道EGF与肿瘤细胞增殖密切关联[23-24]。由此得出，分泌型PKG Ⅱ可能通过下调EGF表达，同时上调DFNA5、DACT1和PSCA表达，促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞增殖，最终抑制肿瘤生长。

除了对肿瘤细胞增殖相关基因的调节作用外，本次测序结果还显示重组PKG Ⅱ对神经系统功能调控和心脏活动的众多基因都有明显的调节作用。例如，重组PKG Ⅱ除了可以通过调节编码钠/钙交换蛋白2的SLC8A2(NCX2)表达抑制肿瘤生长[25-26]；还可通过增强SLC8A2表达，维持突触完整性和突触密度、保证正常的认知和记忆[27]；此外，PKG Ⅱ还可能通过上调编码二氢嘧啶脱氢酶4的DPYSL4表达，从而促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长[28]，保证神经突的正常形成、神经元正常分化，增加树突的数量及长度[29]。可见，分泌型PKG Ⅱ除了可以通过调节肿瘤生物学活动相关基因的表达，影响肿瘤细胞生长，还可能参与调控神经系统和心血管系统的活动。

对EGF前体蛋白水平的检测结果进一步显示，在GST-PKG Ⅱ作用下，HGC-27和AGS细胞中EGF前体蛋白水平较对照组明显降低，加入8-pCPT-cGMP后，GST-PKG Ⅱ对HGC-27细胞中EGF前体蛋白表达的抑制作用更为明显。GST对HGC-27细胞中EGF前体表达无抑制作用，而cGMP加入可能引起细胞中内源性PKG Ⅱ的激活，进而导致EGF前体表达下调。对于AGS细胞株，GST对EGF前体表达也有一定的抑制作用，但与GST组相比，重组PKG Ⅱ组EGF前体表达明显降低(P<0.01)，表明重组蛋白GST-PKG Ⅱ中PKG Ⅱ对EGF前体表达有抑制作用，而非单纯GST起作用。cGMP的加入同样可能导致AGS细胞株中内源性PKG Ⅱ的激活，从而引起EGF前体表达降低。在AGS细胞株中，GST-PKG Ⅱ+cGMP组与GST-PKG Ⅱ组相比差异无统计学意义，表明cGMP激活并不能增强重组PKG Ⅱ对EGF前体蛋白表达的抑制作用。

综上所述，PKG Ⅱ能够作为一种分泌型蛋白激酶调控EGF的转录和翻译，但其抑制EGF表达的机制有待进一步探索。