QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法测定粮谷中16种真菌毒素

王丽娟 ，李 超，陈嘉杰，吴奕萱，杨春艳，安红梅，柯润辉

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；2.中国家用电器研究院，北京 100037）

真菌毒素是由真菌产生的小分子有害次级代谢产物[1]，普遍存在于玉米、大米、小麦以及相关的加工产品中[2]。目前已知有400 多种，其中对人类健康影响巨大的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素等[3-4]。据联合国粮农组织（FAO）统计，每年全球农产品污染率高达25%，损失达10 亿吨；据我国国家粮食局统计，每年有3100 万吨粮食在生产、储存、运输的过程中受到真菌毒素污染，约占粮食年总产量的6.2%，因此需要对其进行监测以控制食物链中的霉菌毒素[5-6]。全世界至少100 个国家通过法规或标准严格规定粮食中主要真菌毒素的限量，并建立了多种用于筛查、确认和定量等不同目的的检测方法对真菌毒素进行监控[7]。我国也高度重视食品中真菌毒素污染问题，已明确将其列入重点关注的污染物质[8]。为了更好地加强对粮食中真菌毒素的监测，保障人畜健康，开发快速、高通量、前处理简单、准确的真菌毒素检测方法具有非常重要的意义[9]。

粮谷中真菌毒素经典的检测技术有薄层色谱法（TIC）[10]、气相色谱法（GC）[11]、酶联免疫吸附法[12]和液相色谱法等[13-14]，这些方法虽然各有优点，但可靠性、灵敏度和检测通量上仍有较大提升空间。近年来，随着液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 技术的发展，因其高通量和高灵敏度，在真菌毒素检测方面的优势越来越明显[15]。LC-MS/MS 采用选择性的离子监测技术手段，对检测的灵敏度和特异性有很大的提高，因此，在处理样品时可以选择比传统方法更简单、更快速的前处理方法。QuEChERS方法自2003 年提出以来，凭借着其实验步骤少、操作简单、对复杂样品净化效率高的优势，在农兽残检测方面的应用日益广泛[16-17]。样品中真菌毒素的提取净化一般是用免疫亲和柱或其他的净化剂进行固相萃取[18]、凝胶固相萃取[19]等，步骤较繁琐、成本较高。因此，本试验综合利用LC-MS/MS 和QuEChERS 方法的优势，在相关研究的基础上，建立了快速、准确测定粮谷中16种真菌毒素的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

大米、小麦、玉米样品：购自零售超市和商店。

仪器：LCMS-8050 高效液相色谱-串联质谱仪（日本Shimadzu 公司，具体配置为LC-20ADXR×2输液泵，DGU-20A3R 在线脱气机，SIL-20AXR 自动进样器，CTO-20AC 柱温箱，CBM-20A 系统控制器，LCMS-8050 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver.5.91 色谱工作站）；Milli-Q Reference 超纯水器（美国Millipore 公司）；超声波清洗器（KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司）；Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7 µm，美国Waters 公司）；0.22 μm尼龙滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）。

试剂及耗材：甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵（HPLC级，Dikma 公司）；黄曲霉素毒素B1、B2、G1、G2、M1、赭曲霉毒素A、T-2 毒素、HT-2 毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3Ac-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15Ac-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇，美国Sigma Aldrich公司，加拿大TRC公司和德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度≥95%。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取16 种生物毒素标准品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1 mg/mL 的单标储备液，于-18 ℃下避光保存。用甲醇稀释并配制中间浓度的标准工作液，于4 ℃下避光保存。根据需要用流动相逐级稀释，配制成适当浓度的混合标准工作液，现配现用。

1.3 样品前处理方法

准确称取粉碎均匀的样品粉末5.00 g（精确到0.01 g），置于50 mL 塑料离心管中，加入20 mL 乙腈-水-乙酸（84∶15∶1，v/v），涡旋振荡3 min，超声20 min，浸泡过夜；加入4 g 无水MgSO4，1g NaCl，涡旋2 min，9000 r/min 离心10 min。取5 mL 上清液，加入120 mg C18，600 mg MgSO4，涡旋2 min，上清液过0.22 μm滤膜，LC-MS/MS测定。

1.4 检测条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7µm，美国Waters公司）。流动相：（A）甲醇/乙腈（v/v∶4/6）和（B）0.1%甲酸水溶液，流速0.30 mL/min；梯度洗脱程序为：0～0.5 min，A 的体积分数为20%；0.5～0.8 min，A的体积分数从20%升至50%，0.8～4.5 min，A的体积分数从50%升至80%，4.5～5.5 min，A 的体积分数从80% 升至90%，5.5～5.6 min，A 的体积分数从90% 降至20%，5.6～7.5 min，A 的体积分数保持20%。柱温为35 ℃；进样体积：2 μL。

1.4.2 质谱条件

分析仪器：LCMS-8050；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正负离子模式同时扫描；离子源接口电压：0.5 kV；雾化气：氮气3.0 L/min；干燥气：氮气10 L/min；碰撞气：氩气；DL 温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：11 ms；延迟时间：3 ms；16 种生物毒素标准品MRM参数：见表1。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

测定真菌毒素流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）等组成，本研究对流动相进行了考察和优化。当采用乙腈为有机相时，组分“共流出”情况较甲醇严重，而选择甲醇为有机相时，出峰时间明显靠后，测定时间延长，且甲醇较乙腈黏度更大，柱压较高，不利于色谱柱及相关仪器配件的长久使用，故采用甲醇/乙腈混合溶剂作为有机相，通过实验发现，甲醇∶乙腈浓度为4∶6 时，可在较短的时间内完成16 种真菌毒素的分离测定。水相通常用缓冲盐溶液或弱酸性溶液，以增加电离度，提升响应值，当采用负离子监测模式测定时，在流动相中加入一定量氨水、乙酸铵等适合负离子模式的盐，实验比较了甲酸水溶液、乙酸铵水溶液、氨水溶液作为水相的测定效果。结果发现，当采用氨水作为水相测定时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物在负离子监测模式下虽有较高的响应值，但黄曲霉毒素等大部分正离子模式测定的毒素响应值较低，无法满足检测需要；当采用乙酸铵水溶液测定时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物响应值很低，且乙酸铵作为非挥发缓冲盐溶液进入质谱，对离子源会造成一定程度的污染；采用甲酸水溶液测定时，可增强正离子监测的目标化合物的响应值，同时，对于负离子监测的化合物同样可以达到较好的响应，进一步试验比较含0.05%、0.1%、0.2%不同浓度的甲酸对真菌毒素的测定效果，发现使用含0.1%的甲酸时，灵敏度和分离度均达到最好，最终选择甲醇∶乙腈（4∶6）、0.1%甲酸水溶液作为流动相。

表1 16种生物毒素的保留时间和质谱条件

2.1.2 流速的选择

在确定了流动相的情况下，对流动相的流速进行了进一步的优化。考察了0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.4 mL/min 3 个不同流速的测定情况。结果发现，当测定流速为0.2 mL/min，出峰时间靠后，测定时间延长；当为0.3 mL/min 时，分离度良好，灵敏度较高；进一步提高流速至0.4 mL/min，测定压力明显提高，且响应值有了不同程度的下降，这主要是由于流速加大，分析柱的保留能力降低，质谱的离子化效率也降低。故最终选择流速0.3 mL/min。

2.2 质谱条件的选择

分别将配制的质量浓度为1 mg/L 的真菌毒素单标准溶液不接色谱柱直接进入质谱中进行质谱条件优化。采用ESI±同时扫描模式进行一级质谱分析，确定其准分子离子，发现5 种黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A 均可得到[M+H]+分子离子峰，5 种玉米赤霉醇类均可得到[M-H]-分子离子峰，T-2 与HT-2 毒素则得到[M+NH4]+分子离子峰，3 种脱氧雪腐镰刀菌烯醇类在[M+H]+和[M-H]-下均有响应，考虑到当脱氧雪腐镰刀菌烯醇在负离子模式下测定时流动相中需加入少量氨水，而氨水会抑制其他真菌毒素的测定，当其在正离子模式下测定时，选取甲酸水溶液，16 种真菌毒素均可达到较高的响应，故脱氧雪腐镰刀菌烯醇选取[M+H]+为其准分子离子，再对母离子进行二级质谱扫描，优化CE，并选取相对丰度较高且稳定的两个特征离子作为定性、定量离子，经仪器自带的质谱参数自动优化程序优化。确定16 种真菌毒素的最佳质谱条件，各化合物的质谱条件见表1。16 种真菌毒素的总离子流图见图1。

图1 16种真菌毒素混合标准溶液的总离子流图

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1 样品提取与净化

由于不同种类真菌毒素的理化性质差异很大，提取溶剂的选择是前处理过程中最重要的环节，直接影响回收率的高低。目前粮食中多组分真菌毒素的提取主要选择甲醇、乙腈等有机溶剂与水的混合液作为萃取溶剂。乙腈的提取率高，适用范围更为广泛，本实验选用乙腈作为提取溶剂，对于极性范围敏感的目标毒素提取时，为保证各种真菌毒素的提取效果，需在提取液中添加辅助试剂（乙酸、甲酸等）以增强联合提取的效果[22]。实验比较了乙腈、水以及酸在不同配比条件下的提取效果，发现乙腈-水-乙酸（84∶15∶1，v/v）作为提取溶剂时，16种真菌毒素的回收率可达到80%以上。

2.3.2 净化方式选择

近年来，QuEChERS 前处理技术广泛应用于农药残留的分析检测中，其高效、简便和绿色的技术理念逐渐在生物毒素等分析检测领域得到应用[20]。C18净化剂在前处理领域里有着广泛的应用，其对脂肪和脂类物质等非极性干扰物有良好的吸附效果。乙二胺-N-丙基（PSA）硅烷作为一种具有吸附活性的试剂，能够有效吸附样品提取液中的脂质、糖类等有机化合物，因此在QuEChERS 前处理过程中备受青睐。实验比较了PSA 和C18分别与无水硫酸镁组合的净化效果发现，当加入PSA 时，OTA 的回收率显著下降，而C18和无水硫酸镁不仅能起到良好的净化效果，还能得到较高的回收率，最终确定C18和无水硫酸镁混合填料作为QuEChERS 净化吸附剂。

2.4 方法学评价

2.4.1 方法的线性范围和检出限

将16 种真菌毒素的标准储备液用空白基质提取液分别配制系列混合标准工作液，按上文1.4 部分确定的色谱及质谱条件进行测定，以各组分定量离子的色谱峰面积对相应的质量浓度绘制各组分的标准工作曲线。结果表明，16种真菌毒素的线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.995。以信噪比为3 确定方法的检出限（LOD），以信噪比为10 确定方法的定量限（LOQ）。结果见表2。

2.4.2 精密度和回收率

分别选取空白小麦、大米、玉米做回收率实验，用微量移液器向空白样品中准确加入一定量的16种真菌毒素标准溶液，配制成低、中、高3 个浓度水平进行回收率实验，按1.3 节所述实验步骤进行处理和测定，进行6 次重复实验，计算其回收率及相对标准偏差（RSD）。结果表明，各目标物平均回收率在90.6%～106.5%之间，相对标准偏差小于8.8%（表3），方法的准确度和精密度均符合多残留分析的要求。

表2 16种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

2.5 实际样品的测定

按所建立的方法对市售共5 批次小麦、5 批次玉米和5 批次大米样品进行了16 种真菌毒素的筛查，每个样品重复测定3 次。除2 批次大米外其他所检样品脱氧雪腐镰刀菌烯醇均有检出，其含量范围为25.6～429.3 μg/kg。

表3 粮谷中16种真菌毒素添加回收率和相对标准偏差(n=6)

3 结论

本研究建立了QuEChERS 结合高效液相色谱-串联质谱同时测定粮谷中16 种真菌毒素含量的方法，该方法灵敏度高、前处理简单、分析速度快。对实际样品的检测表明，该方法可以满足粮谷中16种真菌毒素的分析要求，与国标方法相比，提高了分析效率，降低了分析成本。适合大批量粮谷样品中16种真菌毒素的定性定量分析。