miRNA⁃424⁃5p靶向SIRT4促进胃癌细胞迁移和侵袭的分子机制

陈莉 徐惠丽 王梦漪 张子龙

1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院肿瘤科（武汉430014）；2华中科技大学同济医学院附属荆州医院（湖北荆州434020）

2018年全球胃癌新发病例约100 万例，死亡病例约78.3 万例，严重威胁人类健康［1］。中国作为胃癌高发国家，发病和死亡例数均约占全世界的50%，疾病负担相当严重［2］。胃癌的发生发展是一个多基因、多分子参与的多步骤复杂过程，原癌和抑癌基因的表达失调扮演着重要角色［3］。去乙酰化酶4（sirtuin 4，SIRT4）作为去乙酰化酶家族的成员之一，已被证实在胃癌中显著下调，发挥抑癌作用［4］。然而，其影响胃癌发生发展的上游调控机制尚不清楚。近年来，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）作为一类长度约为20～25 个核苷酸内源性非编码单链小分子RNA，具有很高的保守性，可通过与靶mRNA 3'端非翻译区（3'untransla⁃tional region，3'UTR）完全或不完全的互补结合导致靶mRNA 的降解或翻译抑制，在转录后水平负性调控下游靶基因的表达，从而参与恶性肿瘤的进程［5-10］。在前期，笔者通过生物信息学预测发现，miR⁃424⁃5p 在SIRT4 mRNA 的3'UTR 上存在一个潜在的结合位点，其可能调控SIRT4 的表达进而影响胃癌细胞的生物学过程，然而，相关研究未见报道。基于此，本研究旨在探讨miR⁃424⁃5p 和SIRT4 在胃癌中的作用及具体分子机制，分析其对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 标本采集收集2015年6月至2017年1月于武汉市中心医院接受胃癌根治术的57 例胃癌患者的组织标本，其中，男37 例，女20 例，年龄36 ～80 岁，平均（62.3 ± 7.8）岁。每例患者均取胃癌组织和肿瘤边缘5 cm 处的相应癌旁组织。并收集所有患者的肿瘤大小、病理分型、肿瘤分期等相关临床病理资料。所有患者在术前均经病理证实，且均未接受放化疗等抗肿瘤治疗措施。本研究经武汉市中心医院医学伦理委员会审核批准，所有患者和家属均签署知情同意书。

1.2 实验材料及来源正常人胃上皮细胞系GES⁃1和胃癌细胞系（HGC⁃27，BGC⁃823，SGC⁃7901，MKN⁃28，MKN⁃45）购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清和RPMI 1640 培养液购自美国Gibco 公司；miR⁃424⁃5p mimic 和inhibitor 及Negative control（NC，阴性对照）购自上海吉玛制药技术有限公司；sh⁃SIRT4，SIRT4 及Vector（阴性对照）以及内参U6 引物由武汉博士德公司合成；TRIzol、总RNA 提取试剂盒、Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen 公司；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒购自美国Thermo 公司；RIPA 裂解液以及BCA 定量试剂盒购自美国Invitrogen 公司；抗SIRT4 单克隆抗体和抗GAPDH 多克隆抗体购于美国Abcam 公司；Tran⁃swell 小室购自美国Corning 公司；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega 公司。

1.3 细胞培养和转染用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液培养上述细胞，在37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。选取对数期生长的HGC⁃27 和MKN⁃28 细胞接种于6 孔板中，待细胞融合度为75%左右时利用Lipo2000 参照参照说明书进行转染，包括miR⁃424⁃5p inhibitor或mimic 及其阴性对照，sh⁃SIRT4，SIRT4 及阴性对照。转染后24 h 后于荧光显微镜下观察细胞荧光，检测转染效率。

1.4 RT⁃qPCR检测胃癌组织及细胞中相关基因表达水平Trizol法提取组织或细胞的总RNA，-80 ℃冰箱保存。取1 μg RNA 按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），加入SYBR green染料（Qiagen）进行PCR扩增。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real⁃time RT⁃PCR）的条件为：95 ℃30 s，之后95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 个循环。采用2⁃ΔΔCt法进行数据处理。具体引物如下：miR⁃424⁃5p 的上下游引物分别为：5'⁃GGCT⁃AGTCAGCAGCAATTCATGT⁃3'和5'⁃GTGCAGGGT⁃CCGAGGT⁃3'；SIRT4 的上下游引物分别为：5'⁃AT⁃GAAGATGAGCTTTGCGT⁃3'和5'⁃TCAGCATGGGT⁃CTATCAAAGG⁃3'；U6 的上下游引物分别为：5'⁃TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC⁃3'和5'⁃CCAGTG⁃CAGGGTCCGAGGT⁃3'；GAPDH 的上下游引物分别为：5'⁃AACTTTGGGATTGTGGAAGG⁃3'和5'⁃ACAC⁃ATTGGGGGTAGGAACA⁃3'。

1.5 Western Blot法检测转染后胃癌细胞中SIRT4蛋白的表达水平收集转染后的胃癌细胞，加入提取缓冲液并收集其裂解液，提取总蛋白，应用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。根据蛋白浓度调节上样量，10%浓度的SDS⁃PAGE 胶电泳后进行转膜，按分子量大小剪下相应大小的PVDF 膜在5%脱脂奶粉封闭液中行抗原封闭，加入SIRT4 一抗孵育（1∶2 000 稀释），洗膜后孵育二抗，后进行显影、定影。

1.6 划痕愈合实验转染后，将MKN⁃28 和HGC⁃27细胞在6孔板中培养。当细胞生长至70%～80%融合时，使用20 μL 移液管尖端进行划痕。随后，将分离的细胞用PBS 洗涤3 次，并将细胞在新鲜的RPMI⁃1640 培养基中培养。在设定的治疗时间点（24 h 和48 h）下在光学显微镜下对划痕愈合情况进行成像。通过ImageJ 软件测量划痕的宽度。

1.7 Transwell 侵袭实验预先将matrigel 基质胶铺在Transwell 小室上室。转染24 h 后，胰酶消化各组细胞并使用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为2×104/L，取细胞悬液200 μL，加在Tran⁃swell 小室的上层，Transwell 小室下层加入500 μL含10%血清培养基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h 后取出小室，PBS 清洗后使用湿棉签轻轻拭去上室中未侵袭的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次后使用0.1%结晶紫染色15 min。PBS 清洗后随机选取镜下5 个视野，计数染色细胞。

1.8 双荧光素酶报告基因实验取对数生长期的HGC⁃27 和MKN⁃28细胞接种到96 孔中 用60 ng的混合物共转染平板萤火虫荧光素酶报告基因，6 ng pRL⁃CMV Renilla 荧光素酶报告基因和miR⁃424⁃5p 模拟物或抑制剂。孵育48 h 后，萤火虫和海肾荧光素酶用双荧光素酶报告基因测量活性测定。具体操作按试剂盒说明书要求。

1.9 统计学方法所有实验数据均用SPSS 22.0和GraphPad Prism 统计软件进行分析。实验均重复3 次，计量资料采用均数±标准差表示，两组数据的比较采用LSD⁃t检验，多组数据比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），相关性分析采用使用Spearman 检验；计数资料采用n 表示，用卡方检验进行分析。P< 0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT⁃qPCR 检测miR⁃424⁃5p 和SIRT4 mRNA在胃癌组织中的表达水平及相关性分析笔者前期通过TargetScan、miRDB 和starBase 三个在线数据库进行预测分析取交集发现，SIRT4 可能是miR⁃424⁃5p 的一个潜在下游靶标，见图1A。进一步，笔者通过RT⁃qPCR 检测胃癌及对应癌旁组织中的miR⁃424⁃5p 和SIRT4 mRNA 的表达，结果显示，与癌旁组织相比较，胃癌组织中miR⁃424⁃5p 的表达明显升高（P< 0.000 1），见图1B；而SIRT4 mRNA的表达明显降低（P< 0.000 1），见图1C。相关性分析发现，胃癌组织中miR⁃424⁃5p 和SIRT4 mRNA的表达水平呈明显负相关（r=-0.382，P=0.034），见图1D。同时，笔者以miR⁃424⁃5p 在胃癌组织表达水平的中位值为临界值，将57 例胃癌患者分为低表达和高表达两组，分析其表达水平与患者临床病理学特征的关系，结果显示，miR⁃424⁃5p 高表达与肿瘤的浸润深度、TNM 分期、脉管侵犯和神经侵犯显著相关（均P< 0.05），而与患者的性别、年龄、肿瘤位置、组织病理类型、淋巴结转移及术前CEA 水平均无关（均P>0.05），见表1。

2.2 RT⁃qPCR 检测转染后胃癌细胞中miR⁃424⁃5p 的表达水平RT⁃qPCR 结果显示，miR⁃424⁃5p在胃癌细胞中的表达水平显著高于胃正常黏膜细胞GES⁃1（均P< 0.05），其中在胃癌细胞MKN⁃28中的表达水平最高，而在HGC⁃27 中的表达水平最低，因此，选择MKN⁃28 和HGC⁃27 细胞系作为后续的研究对象，见图2A。转染72 h 后RT⁃qPCR 检测各组细胞中miR⁃424⁃5p 的表达水平，结果显示，与miR⁃NC 组相比，miR⁃424⁃5p mimic 组表达水平显著升高（P< 0.001）；而与inhibitor NC 组相比，miR⁃424⁃5p inhibitor 组表达水平显著降低（P< 0.01），见图2B。

2.3 划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测miR⁃424⁃5p 对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响划痕愈合实验和Transwell 侵袭实验结果显示，与inhibi⁃tor NC 组相比，miR⁃424⁃5p inhibitor 组MKN⁃28 细胞的划痕愈合率和穿透微孔膜的细胞数则均显著降低（均P< 0.01）；而与miR⁃NC 组相比，miR⁃424⁃5p mimic 组HGC⁃27 细胞的的划痕愈合率和穿透微孔膜的细胞数则均显著升高（均P< 0.01），见图3A和3B。

2.4 双荧光素酶实验验证SIRT4 作为miR⁃424⁃5p 靶基因的可能性经点突变构建SIRT4 突变型（SIRT4⁃mutant，Mut）的pcDNA/EGFP 荧光报告载体，见图4A。在MKN⁃28 细胞中共转染miR⁃424⁃5p inhibitor+pcDNA/EGFP⁃WT SIRT4 3'⁃UTR、inhib⁃itor⁃NC+pcDNA/EGFP⁃WT SIRT4 3'⁃UTR，荧光素酶报告实验结果表明，与对照组相比，miR⁃424⁃5p inhibitor 组SIRT4 3'UTR 的荧光素酶活性明显升高（P< 0.01），而共转染miR⁃424⁃5p inhibitor+pcDNA/EGFP⁃Mut SIRT4 3'⁃UTR、inhibitor⁃NC+pcDNA/EGFP⁃ Mut SIRT4 3'⁃UTR，两组的的荧光素酶活性差异不明显，见图4B；而在HGC⁃27 细胞中共转染miR⁃424⁃5p mimic+pcDNA/EGFP⁃WT SIRT4 3'⁃UTR、miR⁃NC+pcDNA/EGFP⁃WT SIRT4 3'⁃UTR，荧光素酶报告实验结果表明，与对照组相比，miR⁃424⁃5p mimic 组SIRT4 3'UTR 的荧光素酶活性明显降低（P< 0.01），而共转染miR⁃424⁃5p mimic+pcD⁃NA/EGFP⁃Mut SIRT4 3'⁃UTR、inhibitor⁃NC+pcDNA/EGFP⁃Mut SIRT4 3'⁃UTR，两组的的荧光素酶活性差异不明显，见图4C。

表1 胃癌组织中miR⁃424⁃5p 表达水平与患者临床病理特征的关系Tab.1 Association of miR⁃424⁃5p expression in gastric tissues with clinicopathologic factors of gastric cancer patients

2.5 RT⁃qPCR和Western blot检测转染miR⁃424⁃5p后胃癌细胞中SIRT4 mRNA 和蛋白的表达水平结果显示，在MKN⁃28 细胞中转染miR⁃424⁃5p in⁃hibitor 后，SIRT4 mRNA 和蛋白的表达水平较inhib⁃itor NC 组明显升高（P<0.01），见图5A 和5B；而在HGC⁃27 细胞中转染miR⁃424⁃5p mimic 后，SIRT4 mRNA 和蛋白的表达水平较miR⁃NC 组均明显降低（P<0.01），见图5C 和5D。

2.6 共转染miR⁃424⁃5p 和SIRT4 对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响为了进一步验证上述结果，我们在MKN⁃28 细胞共转染miR⁃424⁃5p inhibi⁃tor、sh⁃SIRT4 及其对照组，在HGC⁃27 细胞共转染miR⁃424⁃5p mimic、SIRT4 及其对照组。结果显示，SIRT4 下调可显著减弱miR⁃424⁃5p inhibitor 对MKN⁃28 细胞迁移和侵袭能力的抑制作用，见图6A 和6C；同样，SIRT4 上调可显著减弱miR⁃424⁃5p mimic 对HGC⁃27 细胞迁移和侵袭能力的增强作用，见图6B 和6D。

3 讨论

MiRNAs 具有广泛的基因调节功能，广泛参与肿瘤细胞的多种生物学过程，在恶性肿瘤的发生发展中扮演着重要角色［5-8］。新兴证据证实，多条miRNAs 的表达失调与胃癌的恶性生物学表型密切相关［8，11-14］。miR⁃424⁃5p 作为新近发现的与恶性肿瘤密切相关miRNAs 分子，在多种恶性肿瘤中异常表达并发挥不同的生物学功能：WANG 等研究发现miR⁃424⁃5p 在食管鳞状细胞癌组织和细胞系中均表达下调，其可通过靶向抑制SMAD7通路介导的上皮间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）过程进而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移［15］；WANG 等［16］发现在基底样乳腺癌中miR⁃424⁃5p 通过靶向DCLK1 抑制乳腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭，发挥抑癌功能；同样，miR⁃424⁃5p 也被发现在肝癌组织中低表达，其可通过抑制YAP1 的表达减弱肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡［17］。本研究发现，miR⁃424⁃5p 在胃癌组织中的表达水平较其癌旁组织明显升高，且其高表达与肿瘤的浸润深度、TNM 分期、脉管侵犯和神经侵犯等不良临床病理因素显著相关（均P<0.05）；进一步的功能实验发现，过表达miR⁃424⁃5p 能促进胃癌细胞迁移和侵袭能力，而抑制miR⁃424⁃5p 表达则呈现出相反的效果。本研究结果与既往研究相符：WEI 等［18］研究发现miR⁃424⁃5p 高表达可促进胃癌细胞的增殖；同时，ZHANG 等［19］也发现miR⁃424⁃5p 在胃癌中的上调表达可促进胃癌细胞的增殖和侵袭。上述结果表明，miR⁃424⁃5p 在恶性肿瘤中的作用具有癌种异质性，与在食管癌、乳腺癌和肝癌中不同，miR⁃424⁃5p 在胃癌的发生和发展中可能发挥促癌作用。

图1 miR⁃424⁃5p 和SIRT4 mRNA 在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平及相关性分析Fig.1 Expression and correlation of miR⁃424⁃5p and SIRT4 mRNA in gastric and adjacent normal tissues

图2 转染后胃癌细胞中miR⁃424⁃5p 的表达水平Fig.2 The expression level of miR⁃424⁃5p in gastric cancer cells after transfection

图3 划痕愈合实验和Transwell 侵袭实验检测miR⁃424⁃5p 对胃癌细胞迁移（A）和侵袭（B）能力的影响Fig.3 The effects of miR⁃424⁃5p on migration（A）and invasion（B）of gastric cancer cells by wound⁃healing assay and Transwell invasion assay

图4 双荧光素酶实验验证SIRT4 作为miR⁃424⁃5p 靶基因的可能性Fig.4 The possibility of SIRT4 as a miR⁃424⁃5p target gene validated by dual luciferase gene reporter assay

图5 转染miR⁃424⁃5p 对胃癌细胞SIRT4 mRNA 和蛋白表达水平的影响Fig.5 Effect of miR⁃424⁃5p transfection on the expression of SIRT4 mRNA and protein in gastric cancer cells

图6 共转染miR⁃424⁃5p 和SIRT4 对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响Fig.6 The effects of co⁃transfection of miR⁃424⁃5p and SIRT4 on the migration and invasion of gastric cancer cells

SIRT4 作为Sirtuin 家族中特征最不明显的成员之一，被报道为一种的重要抑癌基因，目前已被证实在多种恶性肿瘤中表达下调，与肿瘤的发生、发展以及预后密切有关［4］。目前，关于SIRT4 在胃癌中作用的研究较少：HUANG 等［20］研究发现SIRT4 在胃腺癌中的表达降低，且其低表达与多种不良临床病理学因素显著相关；SUN 等［21］通过一系列细胞功能实验发现，SIRT4 可抑制EMT 进程进而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力；HU等［22］则发现过表达SIRT4 通过抑制ERK 的磷酸化以及细胞周期相关蛋白cyclin D、cyclin E 的表达诱导胃癌细胞的G1 期停滞，从而抑制胃癌细胞的增殖。上述研究均表明，SIRT4 在胃癌中发挥抑癌作用，但未对其上游调控机制进行探究。在本研究中，笔者首先利用3 个在线软件TargetScan，miRDB 和starBase 进行联合预测，均提示SIRT4 可能作为miR⁃424⁃5p 的下游靶基因。进一步的双荧光素酶实验结果证实miR⁃424⁃5p 可与SIRT4 3'UTR 结合，从而有效减少脱靶效应的可能性，证实SIRT4 是miR⁃424⁃5p 的下游靶基因。后续的一系列细胞实验表明，敲低或过表达miR⁃424⁃5p 可引起SIRT4 mRNA 和蛋白的表达水平的显著上调或下调，进一步证实了SIRT4 是miR⁃424⁃5p 的下游靶基因。上述结果表明，miR⁃424⁃5p 可通过结合到SIRT4 的3'UTR，促进SIRT4 mRNA 的降解，在转录后水平调控SIRT4 蛋白的表达，从而影响胃癌的发生、发展。

综上所述，miR⁃424⁃5p 可通过靶向抑制抑癌基因SIRT4 的表达促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，从而参与胃癌的的发生、发展。miR⁃424⁃5p 作为一种致癌基因，可能成为胃癌治疗的潜在新靶点。