福美加对去势骨质疏松大鼠长骨干骺端骨组织计量学和生物力学的影响

袁伟权 黎艺强 陈志鹏 林玮 赵胜利 莫小毅 陈柏龄

1中山大学附属第一医院脊柱外科（广州510080）；2广东省骨科学重点实验室（广州510080）；3广州市妇女儿童医疗中心骨科（广州510623）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是常见的全身性骨骼疾病，表现为骨密度降低、骨微结构损坏、骨强度降低和易发生脆性骨折［1-2］。绝经后骨质疏松症是OP 中最常见的一种。据估计，全世界超过2 亿人患有OP，欧美国家大约30%的绝经后妇女患有OP［3］。双膦酸盐是治疗原发性骨质疏松症的一线药物，能特异的与骨质中的羟膦灰石结合，抑制破骨细胞活性，从而抑制骨质吸收［4-5］。福美加（阿仑膦酸钠维D3）为阿仑膦酸钠和维生素D3的复方制剂，是目前临床上常用的抗骨质疏松药物，能显著抑制骨质流失，增加骨密度，减少髋部、椎体和非椎体骨折［6-7］。既往研究中，OP 治疗的疗效观察主要集中在骨密度及骨代谢产物方面［8］，而在干骺端骨组织形态学和生物力学方面的结论尚未知晓。本研究旨在探讨福美加对去势骨质疏松大鼠长骨干骺端骨组织计量学和生物力学的影响，进一步观察松质骨富集区和皮质区在骨质疏松发病和治疗过程中的变化情况对骨质疏松的预测、预防和治疗具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物3月龄雌性SPF 级Sprague Dawley（SD）大鼠30 只，由广东省医学实验动物中心提供。动物饲养环境为SPF 级，温度为（25 ± 1）℃，相对湿度为55%，每日照明12 h，分笼饲养，自由进食水和饲料。本研究经过中山大学实验动物伦理委员会批准。福美加（2800U）由杭州默沙东制药有限公司提供（国药准字J20140022）。

1.2 动物分组将大鼠编号，用随机数表法将其随机分成3组，每组10只，分别为假手术组（Sham）、去卵巢组（OVX）和福美加组（ALN）。其中OVX、ALN 组大鼠采用背部脊柱旁切口行双侧卵巢切除术，Sham 组大鼠采用相同切口，保留卵巢及输卵管等结构功能完整，于卵巢周围切除相同体积的脂肪组织。

1.3 动物给药造模8 周后，ALN 组给予大鼠等效剂量7 mg/kg 的福美加，每周灌胃1 次。Sham 和OVX 组每周灌服10 mL/kg 的生理盐水。福美加剂量的选择根据NAIR 等［9］报道的动物与人之间药物剂量转换进行等效剂量换算。所有的处理持续12 周后，将所有大鼠处死获取股骨、胫骨和腰5 椎骨。

1.4 实验方法

1.4.1 骨密度测量获取的股骨和腰5 椎骨，采用双能X 线吸收测定法（DXA，GE LUNAR⁃Prodigy，Madison，WI，USA）测量股骨和第5腰椎的骨密度。

1.4.2 骨组织计量学检测所有大鼠的胫骨行骨组织形态学检查。具体方法与我们之前的研究［10］相似。将胫骨用4%多聚甲醛固定24 h，用不同浓度的乙醇（70%、95%和100%）梯度脱水24 h，浸蜡包埋。然后用SP2500 切片机（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）在胫骨干骺端制作冠状切片，切片厚度为5 μm，Masson 三色染色试剂盒对切片进行染色。采用半自动数字化图像分析软件（BioQuant Osteo 2009）进行骨组织形态学分析。分析结果包括总组织体积（TV）、骨体积（BV）和骨表面积（BS）等。然后根据这些参数计算出骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.4.3 骨生物力学指标测定骨生物力学指标测定在材料测试系统（MTS 858 bionix Ⅱmachine，MTS System Inc.，Minneapolis，MN，USA）下进行。每只大鼠的股骨均被随机分配进行股骨干弯曲试验和股骨干骺端弯曲试验。这两种生物力学弯曲试验测定方法与我们之前的研究相同［10-11］。将股骨干和干骺端（骨骺近5 mm）分别水平固定在MTS 平台上，并向其施加5 mm/min 恒定位移的垂直力，直到股骨样本破坏。记录载荷和位移，根据载荷-位移曲线计算了最大载荷、破坏载荷和刚度［11］。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用单因素方差分析，多组间比较采用LSD⁃t检验法。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨密度ALN 组大鼠1只在实验结束前死亡，被排除在外。不同组别大鼠的体质量和骨密度结果见表1。实验前大鼠组间在体质量上无明显差异。实验结束时，Sham 组大鼠体质量明显低于其他组（P<0.05）。ALN和OVX组的体质量差异无统计学意义（P>0.05）。OVX组股骨和L5椎体骨密度明显低于ALN 组（P< 0.05）。ALN 和Sham 组股骨和L5 椎体骨密度差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 不同组别大鼠的体质量（g）和骨密度（g/cm2）Tab.1 Body weight（g）and BMD（g/cm2）of the rats in groups±s

表1 不同组别大鼠的体质量（g）和骨密度（g/cm2）Tab.1 Body weight（g）and BMD（g/cm2）of the rats in groups±s

组别实验前体质量实验后体质量股骨骨密度L5椎体骨密度OVX（n=10）238.2±37.5 361.3±22.2 0.202±0.029 0.149±0.014 Sham（n=10）251.2±30.7 310.5±37.6 0.221±0.033 0.172±0.011 ALN（n=9）236.6±33.2 365.1±18.4 0.241±0.018 0.177±0.011 P值0.748 0.001 0.006<0.001

2.2 骨组织计量学Sham 和ALN 组骨量明显高于OVX 组（图1A）。ALN 组骨质量参数（BV/TV，Tb.N，Tb.Th）均明显大于OVX 组（P< 0.05，图1B）。在骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）上，ALN 和Sham 组之间差异无统计学意义（P>0.05，图1B）。

2.3 生物力学股骨干弯曲试验和股骨干骺端弯曲试验结果见表2。Sham 和ALN 组股骨干及干骺端的最大载荷、破坏载荷和刚度明显高于OVX 组（P< 0.05）。Sham 和ALN 组之间股骨干生物力学参数无明显差异（P> 0.05）。OVX 组与ALN 组股骨干骺端弯曲试验最大载荷、破坏载荷的均值显著高于股骨干弯曲试验（P< 0.05，图2）。

表2 不同组别两种生物力学指标测定结果Tab.2 Biomechanical results in groups ±s

表2 不同组别两种生物力学指标测定结果Tab.2 Biomechanical results in groups ±s

组别骨干弯曲试验最大载荷（N）破坏载荷（N）刚度（N/mm）干骺端弯曲试验最大载荷（N）破坏载荷（N）刚度（N/mm）OVX（n=10）101.01±12.60 85.08±8.17 106.62±14.77 60.24±2.82 41.57±5.33 66.70±8.20 Sham（n=10）119.56±15.56*106.44±13.73*147.83±14.60*108.07±15.29*91.94±10.31*110.21±13.25*ALN（n=9）127.98±14.62*110.14±13.68*143.30±14.26*106.63±14.40*92.13±13.23*100.92±12.11*

3 讨论

图2 两种股骨弯曲试验ALN⁃OVX 平均差值的比较Fig.2 Comparison of mean difference ALN⁃OVX in two femur bending tests

绝经后骨质疏松症是原发性骨质疏松症中最常见的类型［2］。3月龄雌性大鼠的性器官已经成熟、体重已趋于稳定，体内骨的形成和吸收处于平稳状态［12］，能很好地模拟绝经后的OP。在本研究中，我们采用卵巢切除大鼠骨质疏松模型，观察到OVX 组大鼠骨骺部松质骨富集区较Sham 组明显减少，而经过福美加治疗后大鼠骨骺部松质骨富集区明显增多并与Sham 组无明显差异，而在皮质区上则未见明显差异。这可能是由于在雌激素缺乏诱导的OP 模型中，干骺端松质骨富集区骨量的丢失早于皮质区［13］，而福美加的运用，能逆转雌激素缺乏诱导的松质骨富集区骨量丢失。既往有研究表明卵巢切除大鼠股骨骨干未见BMD、骨几何学或机械强度的改变，可能是因为皮质骨比松质骨更不易受卵巢切除影响而引起骨丢失［14］。而在JU 等［13］的研究中发现，卵巢切除大鼠模型中松质骨富集区小梁骨的厚度、数目和连接减少。破骨细胞和成骨细胞的活动失衡是绝经后骨质疏松症的主要原因［15］。阿仑膦酸盐与骨骼羟磷灰石的亲和力高，能特异性地结合到骨表面抑制破骨细胞的功能，抑制松质骨富集区骨的吸收来减少骨重塑，而在皮质骨组织中则未见明显改变［16-17］。福美加能逆转雌激素缺乏诱导的松质骨富集区骨量的丢失，这可能与钙磷代谢密切相关［18］。有研究表明绝经后骨质疏松妇女运用福美加一段时间后能明显改善血清和尿中钙磷及相关代谢物的含量［19］、减少骨量丢失和提高腰椎BMD［18］。SAKKA 等［8］在治疗Hajdu⁃Cheney 综合征时发现阿仑膦酸盐的运用可提高患者腰椎BMD 和纵向皮质厚度和密度。研究发现，类固醇可通过增强皮质骨的形成进而增加大鼠长骨的尺寸、骨密度和强度，而雌激素则可通过抑制骨吸收来维持松质骨富集区骨小梁的骨密度［20］。MOSEKILDE 等［16］观察单侧后肢固定大鼠模型4 周后发现松质骨富集区骨强度显著下降约16%～28%，而骨干中央区皮质骨未观察到明显的变化。TOLEDANO 等［21］提出骨小梁质量的测定可以衡量骨质疏松的程度。总体而言，笔者认为绝经后骨质疏松患者骨量的丢失是从松质骨富集区小梁骨丢失开始，逐渐发展到皮质骨骨量的丢失，而福美加等药物的运用早期即可通过抑制松质骨富集区骨的吸收来增强骨的强度、提高患者的骨质量和骨密度。因此，骨骺部松质骨富集区骨量情况可作为骨质疏松早期诊断和药物治疗的监测部位，将对骨质疏松的早期诊断和治疗监测发挥重要的作用。

雌激素缺乏可使干骺端骨小梁体积减少，增加远端干骺端和骨干中央区皮质骨的体积［22］。THORMANN 等［23］在研究骨质疏松与生理性骨骺端骨折愈合中发现，骨质疏松性骨和非骨质疏松性骨的干骺端骨缺损愈合存在差异。目前，动物股骨生物力学实验常用检测方式为股骨干弯曲试验，即三点弯曲试验［8，24］。股骨干弯曲试验在诊断骨质疏松和早期治疗疗效观察中存在灵敏度较差、差异性较大的情况［11］。绝经后骨质疏松早期和骨质疏松治疗早期，骨量的丢失和生成主要集中在松质骨富集区［25-26］，而股骨干骺端弯曲试验可反映干骺端松质骨富集区骨强度的情况。我们既往的研究表明股骨干骺端弯曲试验可用于评估骨质疏松大鼠的股骨生物力学特性变化，且具有灵敏度较高，稳定性较好的特征［11］。本研究进行了两项生物力学试验的比较，发现股骨干骺端弯曲试验最大载荷和破坏载荷中，OVX 组与治疗组的差值差异显著高于股骨干弯曲试验。表明股骨干骺端弯曲试验可用于评估骨质疏松的诊断和治疗疗效观察，并且股骨干骺端弯曲试验在评估骨质疏松大鼠的生物力学性能变化方面比股骨干弯曲试验更敏感。

综上所述，雌激素缺乏诱导的骨质疏松，松质骨富集区骨量丢失较皮质区明显。福美加的运用可显著提高骨质疏松大鼠的骨密度、骨组织计量学参数和生物力学性能，且作用于长骨干骺端松质骨富集区的效果大于皮质区。在今后的研究中，我们将进一步探讨抗骨质疏松药物预防、治疗骨质疏松的具体机制和分子机制，与临床相结合，为骨质疏松的早期预测、预防和治疗提供新的证据。