缺血性卒中患者IL-23受体基因多态性与颈动脉粥样硬化及斑块易损性的相关性研究

高媛雪， 徐志昊， 李建刚， 鱼 海， 张建军

众所周知，颈动脉粥样硬化斑块是缺血性卒中最主要的危险因素之一。目前，越来越多学者认识到颈动脉斑块的危害不仅在于其在血管局部造成的管腔狭窄，斑块不稳定性和破裂对脑缺血的影响可能更值得关注[1,2]。白细胞介素(interleukin，IL)-23作为一种促炎细胞因子，可与IL-17的辅助性T细胞17(T helper cells 17，Th17)组成IL-23/Th17炎症通路，诱导IL-17分泌，在动脉粥样硬化(atheroscleerosis，AS)发生发展进程中发挥重要作用[3～5]。IL-17可刺激巨噬细胞释放IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-β等炎性因子以促进AS，增加斑块不稳定性[6,7]；同时IL-17还可以促进成纤维细胞和上皮细胞释放多种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，如MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13等，促进斑块中纤维降解继而导致斑块破裂[8,9]。IL-23受体(interleukin-23 receptor，IL-23 R)作为IL-23途径的重要组成部分，也可能与AS密切相关。近年来，相继有研究发现IL-23R基因存在多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点与临床疾病易感性相关[10,11]。Rs6682925是其中关注较多的SNP位点之一，多项研究结果显示rs6682925 CC基因型是急性冠脉综合征的危险因素[12～14]。因此，本研究认为有理由推测IL-23R基因多态性与颈动脉粥样硬化及斑块稳定性均密切相关。为此，本研究以缺血性卒中患者为研究对象，检测IL-23R基因rs6682925位点基因型，探讨其与颈动脉粥样硬化及斑块易损性的关系，旨在为动脉粥样硬化发生发展寻找新的分子遗传学标记。

1 资料和方法

1.1 一般资料 经我院伦理委员会审核批准通过，连续收集2019年1月-2019年10月于我科就诊的460例缺血性卒中患者纳入研究，包括男276例，女184例，平均年龄(65.32±10.57)岁。纳入标准：(1)年龄40岁～85岁；(2)缺血性卒中诊断符合2014年中华医学会神经病学分会指定的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》[15]；(3)临床资料完整，包括颈动脉超声检查及其他血液检测结果等；(4)长期居住陕西地区的汉族人。排除标准：(1)心源性缺血性卒中；(2)存在动脉炎、梅毒、放射性治疗等可能导致颈动脉斑块因素；(3)既往接受颈动脉斑块剥脱或支架植入治疗；(4)合并严重的肝肾脏器疾病、恶性肿瘤；(5)妊娠期女性。按照颈动脉彩超结果分为3组，无斑块组、稳定斑块组和易损斑块组，其中无斑块组共112例，包括男60例，女52例，平均年龄(63.72±10.48)岁；稳定斑块组共164例，包括男98例，女66例，平均年龄(66.08±10.15)岁；易损斑块组共184例，包括男118例，女66例，平均年龄(65.62±11.39)岁，3组间性别及年龄差异均无统计学差异，具有可比性。

1.2 方 法

1.2.1 颈部血管超声检查 所有检测人员经过统一培训，使用东芝Aplio-500超声诊断仪，检测双侧颈总动脉内径及颈动脉内膜中层厚度(carotid intima media thickness，CIMT)，将CIMT≥1.5 mm并凸向管腔内作为诊断颈动脉斑块的标准。采用常规超声联合微血流成像(superb micmvascular imaging，SMI)技术评价颈动脉斑块性质，将颈动脉斑块分为稳定斑块和易损斑块，易损斑块的超声回声及血流特征：低回声或极低回声；斑块内部含低-无回声区；溃疡斑块；新生血管形成斑块。本研究将两侧均为未检出颈动脉斑块者记入无斑块组；至少一处斑块符合易损斑块超声回声及血流特征者记入易损斑块组；余者记入稳定斑块组。

1.2.2 IL-23R基因rs6682925位点基因型检测 采用聚合酶链反应联合DNA直接测序法检测IL-23R基因rs6682925位点基因型。采用Primer Premier5.0软件设计引物，由生工生物工程(武汉)股份有限公司合成，上游引物：5’-GATCCAGCAATCCCTCTTCT-3’，下游引物：5’-CTCCACCACCCTCTAACCTT-3’，扩增片段大小378 bp。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性3 min，然后按照95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s顺序循环30周期，最后72 ℃延长10 min。扩增产物经虾碱性磷酸酶及ExonI纯化。最终产物使用美国ABI 3730XL自动测序仪进行检测，使用SeqScape软件对测序结果进行分析。

2 结 果

2.1 3组间基本临床特征比较 稳定斑块组和易损斑块组糖尿病、收缩压、三酰甘油，与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；易损斑块组空腹血糖与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3组在年龄、性别、体质指数、吸烟、高血压、血脂异常、舒张压、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇等方面差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.2 3组间rs6682925位点基因型和等位基因频率比较 无斑块组rs6682925位点TT、TC和CC基因型频率分别为43.75%、41.96%和14.29%；稳定斑块组TT、TC和CC基因型频率分别为31.10%、43.29%和25.61%；易损斑块组TT、TC和CC基因型频率分别为31.52%、40.76%和27.72%。3组rs6682925位点基因型分布频率经检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)，具有良好群体代表性。稳定斑块组和易损斑块组基因型和等位基因频率与无斑块组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；稳定斑块组基因型和等位基因频率与易损斑块组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

2.3 rs6682925位点基因型与颈动脉粥样硬化的关联分析 采用二分类Logisitic回归分析法，校正年龄、性别、年龄、性别、糖尿病、收缩压、空腹血糖和三酰甘油等参数，结果显示在缺血性卒中患者中IL-23R基因rs6682925位点CC基因型携带者，相对于TT基因型，稳定斑块和易损斑块发生风险均显著增加，CC基因型携带者颈动脉斑块总体发生风险是TT基因型携带者的2.616倍(95%CI1.399～4.904，P=0.001)(见表3)。

表1 3组基本临床特征比较

注：与无斑块组比较*P<0.05

表2 3组间rs6682925位点基因型和等位基因频率比较

表3 rs6682925位点基因型与颈动脉粥样硬化的关联分析

注：斑块组=稳定斑块组+易损斑块组；a校正年龄、性别、糖尿病、空腹血糖和三酰甘油等

3 讨 论

随着对AS认识的不断深入，炎症反应在AS发生发展中的关键作用得到了越来越多的共识。炎症既是AS重要的起始因素，也是动脉粥样硬化斑块不断进展，乃至斑块破裂的促进因素。IL-23是2000年才被发现的一种白介素家族成员，主要表达与树突状细胞和巨噬细胞中。基础研究发现IL-23可通过诱导Th17细胞分泌IL-17等炎性介子，级联放大炎性反应[3,4]。但是，长期以来IL-23/Th17通路的相关研究主要集中在自身免疫性疾病领域，已证实IL-23/IL-17通路参与炎症性肠病、银屑病、强直性脊柱炎和变应性鼻炎等疾病的发展[16]。近年来，不断有研究报道IL-23/Th17通路还可能参与AS病理过程[3～9]。黄珊等[17]研究发现 IL-23/Th17炎症轴可通过激活NF-κB信号通路促进冠心病及AS炎症反应。Abbas等[3]研究发现存在颈动脉粥样硬化斑块的患者血浆IL-23表达水平较健康对照组显著升高，颈动脉粥样硬化斑块中IL-23和IL-23R的mRNA均表达上调。此外，该研究还发现高血浆IL-23水平可增加患者死亡率。但也有研究结果得到不同结论，如Engelbertsen等[18]在IL-23R基因敲除小鼠中发现IL-23R缺乏，尽管与T细胞分化及IL-17表达密切相关，但并不影响AS进展。因此，有必要继续深入探讨IL-23/Th17炎症轴及其中成员在AS中的具体作用。

目前，IL-23R基因多态性与临床疾病的相关性是该领域的研究热点。研究报道IL-23R基因存在多个SNP位点与冠心病遗传易感性密切相关[12～14]。Kave等[13]研究发现rs11209026基因多态性与冠脉病变程度相关。Zhang等[12]研究发现rs6682925与冠心病有关联，携带C等位基因可能是冠心病的危险性因素。Zhao等[14]研究结论与之相似。王栋等[19]研究发现携带rs6682925 CC基因型较TT基因型不稳定心绞痛及心肌梗死的患病风险均显著升高。但IL-23R基因多态性与颈动脉硬化及斑块易损性的相关性研究目前仍鲜有报道。本研究结果显示缺血性卒中患者rs6682925基因多态性与颈动脉粥样硬化斑块形成密切相关，CC基因型携带者颈动脉斑块总体发生风险是TT基因型携带者的2.616倍，但本研究未发现该位点基因多态性与颈动脉斑块易损性存在相关性。再次提示IL-23/Th17炎症轴在AS中发挥关键作用，但其中各个成员的实际生物学作用及分子机制有待进一步深入研究。

IL-23R基因rs6682925位点位于转录起始位置上游907 bp处的基因内含子区域，该位点T到C的突变可影响外显子的剪接及转录因子与启动子区的结合，在转录和翻译层次影响IL-23R表达。Xu等[20]通过荧光素酶检测发现rs6682925 C等位基因可能增加IL-23R的启动子活性。Zhang等[12]研究发现冠心病组中，携带TC/CC基因型较TT基因型患者外周血单个核细胞IL-23R mRNA表达水平显著上调。王栋等[19]研究结果显示急性冠脉综合征患者外周血中血清可溶性IL-23R表达量较对照组明显升高，但在病例组和对照组中，不同基因型患者血清可溶性IL-23R表达量差异均无统计学意义。

综上所述，本研究发现IL-23R rs6682925基因多态性与颈动脉硬化密切相关，携带CC基因型可显著增加颈动脉粥样硬化斑块的发生风险，但该位点基因多态性与颈动脉斑块易损性无明确相关性。最后，本研究尚存在以下缺陷：首先，本研究未能深入研究IL-23R rs6682925基因多态性影响颈动脉粥样硬化的分子机制。其次，限于条件本研究关于颈动脉粥样硬化及斑块易损性的评估均主要依据二维超声结果，与目前更精确的检查方式比较，结果可能存在一定误差。再次，为提高颈动脉硬化及易损斑块的检出率，本研究纳入研究对象均为缺血性卒中患者，使得其结果适用具有一定限制。最后，作为单中心研究，本课题所纳入的研究对象仍相对较少，期待后续多中心大样本及严格设计的临床试验结果进一步验证。