星形胶质细胞在帕金森大鼠中的作用机制研究

李承家， 秦丽红， 李承泽， 龚张鋆， 陈 洋， 王 辰

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，主要病理改变为黑质-纹状体多巴胺能通路变性。黑质纹状体多巴胺能神经元死亡，多巴胺分泌减少是帕金森病的一个重要病理特征。星形胶质细胞是胶质细胞的一种，是脑内最广泛的一类细胞。它们伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持、保护和分隔神经细胞的作用。星形胶质细胞在大脑中还有许多更加重要复杂的功能。而目前研究表明[1,2],星形胶质细胞在PD病变过程中发挥着重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取由佳木斯大学动物中心提供健康雄性SD大鼠130只，月龄2.5～3 m，体重210～240 g，健康情况良好，用于PD大鼠模型100只，其中50只移入2型星形胶质细胞(type 2 Astroyts T2As)为PD+T2As组，余50只PD大鼠注射等量的生理盐水于纹状体为PD组；正常大鼠30只，注射等量的生理盐水于正常SD大鼠纹状体中，为对照组。

1.2 帕金森病大鼠模型的制备 给予SD大鼠腹腔注射4%的水合氯醛，麻醉后,固定于立体定向仪。使十字点前囟和人字点后囟相平，当门齿杆位置低于水平0度时，则颅骨水平位达成。在颅骨表面注药点处钻1个约2 mm的小孔。分别在以下两点处各注入10 μg/5 μl含0.2%抗坏血酸的6-OHDA盐溶液。第一点:前囟前1 mm，中线右侧3.0 mm，硬膜下5 mm；第二点：前囟后0.2 mm，中线右侧+2.6 mm，硬膜下6.0 mm。速度为1 μg/min，注射后留置4 min退出，缝合皮肤，碘酒擦拭缝合处。每天腹腔给予20万U青霉素，共7 d以预防感染。模型建立2 w后，用阿朴吗啡(apomnphine，APO)诱发旋转，选210转/30 min以上的动物为成功PD模型。对照组以生理盐水代替6-OHDA盐溶液,其余步骤与模型制作组相同。

1.3 T2As的分离纯化及移植 取大脑皮质分散，用0.125%的胰酶消化7 min(37 ℃)，加含15%胎牛血清的完全培养基终止胰酶的消化作用，吸管反复吹打至细胞分散，得到单细胞悬液。以 3×105/cm2的细胞密度接种于培养瓶中，于培养箱中孵育30 min，以去除成纤维细胞。吸出细胞悬液，再接种于5%CO2培养箱中培养。收集未贴壁的O-2A祖细胞用筛网过滤，滤液经1000 rpm离心5 min，倒掉上清液，细胞因子培养液重悬后接种于PLL包被的六孔培养板中。将分离纯化的O-2A祖细胞放于含20%FCS 的培养液中培养3 d，即可分化为T2As。将分离纯化的T2As移植入PD大鼠的患侧纹状体，步骤与模型制作组相同。

1.4 单胺类递质含量的测定 行为学实验结束后，每周分别随机选择10只大鼠，行单胺类递质含量的测定取大鼠纹状体，液氮冷冻后存于-80 ℃冰箱。样品处理：纹状体组织准确称重，按照1∶10的比例加人0.4 mol/L高氯酸，除去蛋白，高速冷冻离心机12000 r/min 4 ℃ 离心15 min。取上清，再置于12000 r/min 4 ℃ 离心20 min。取上清液加样行，应用高效液相色谱-电化学法测定各组大鼠纹状体内多巴胺含量，检测各样品的多巴胺(DA)，DA的代谢产物3,4二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香芳酸(HVA)的含量。用外标法定量，以峰面积表示其含量。

2 结 果

2.1 大鼠旋转行为的旋转速度、维持时间测定 注射APO后诱导的旋转行为表现为：头部和躯干弯向健侧(左侧)旋转，伴有震颤、咬尾足、尾部僵直等异常行为。健康对照组无旋转行为。PD组出现明显的旋转行为，各周均数采用Bonfferonit检验，发现术后4 w达到较高水平，与第2周、第3周相比升高明显(P<0.01)，PD+T2As组在第4～6周，与PD组比较旋转速度明显降低(P<0.01)(见表1)，大鼠维持旋转行为的时间叫维持时间。PD组旋转时间逐渐升高，到第4周后趋于稳定，PD+T2As组在第4～6周，与PD组比较旋转速度明显降低(P<0.01)(见表2)。

2.2 大鼠单胺类神经递质(DA、DOPAC、HVA)的含量变化 健康对照组单胺类神经递质(DA、DOPAC、HVA)各周比较均无明显差别(P>0.05)，PD组与对照组比较单胺类神经递质(DA、DOPAC、HVA)明显低于对照组(P<0.01)，移植T2As后，DA、DOPAC、HVA含量逐渐升高，在第4周开始与第2周相比具有明显区别(P<0.01)。在第3周开始均明显高于PD组(P<0.01)(见表3～表5)。

表1 大鼠每周的旋转速度转/分)

与PD组比较*P>0.05;与PD组比较#P<0.01

表2 大鼠旋转行为的维持时间

与PD组比较*P>0.05;与PD组比较#P<0.01

表3 大鼠纹状体部位的DA含量变化

与对照组比较◇P<0.01;与PD组比较*P>0.05;与PD组比较#P<0.01;与同组第2周、第3周比较均△P<0.01

表4 大鼠纹状体部位的DOPAC含量变化

与对照组比较◇P<0.01;与PD组比较*P>0.05;与PD组比较#P<0.01;与同组第2周、第3周比较△P<0.01

表5 大鼠纹状体部位的HVA含量的变化

与对照组比较◇P<0.01;与PD组比较*P>0.05;与PD组比较#P<0.01;与同组第2周比较△P<0.01

3 讨 论

在中枢神经系统神经元的发育过程中,星形胶质细胞(astrocyte,As)始终伴随着其发育过程,不仅能起到支持和隔离的作用,还能起到调节细胞内外离子浓度、摄取、供给及灭活神经递质、传递第二信使等功能。近年来,有报道[3,4]星形胶质细胞能分泌神经营养因子及释放可溶性分子，进而保护神经元，对神经损伤具有清除作用。本实验通过建立PD大鼠模型后将2型星形胶质细胞移植到PD大鼠纹状体内，观测3组大鼠(PD+T2As组、PD组、对照组)行为学改变(启动时间、旋转速度和维持时间)，同时观察单胺类神经递质(DA、DOPAC、HVA)在纹状体中的变化，以期探究2型星形胶质细胞在PD大鼠中的作用。

应用6-OHDA建立大鼠PD模型的方法，有黑质内注射法、内侧前脑束注射法和纹状体内注射法。纹状体较黑质体积大，注药准确性高，模型更稳定，故本实验采取两点纹状体内注射法，同时损毁尾壳核和苍白球外侧段，损伤更完全，6-OHDA注入纹状体后，可被多巴胺能神经末梢摄取，逆行性损毁黑质内多巴胺能神经元。此过程是渐进性的，可以模拟PD的发病过程。根据实验结果可见3组大鼠的旋转速度、维持时间具有明显区别，对照组明显优于PD组和PD+T2As组，PD+T2As组从第4周开始较PD组有显著改善；单胺类神经递质(DA、DOPAC、HVA)在纹状体中的含量在3组中的测定，结果提示从第3周开始PD+T2As组显著高于PD组，PD组和PD+T2As组单胺类神经递质含量在第2～6周均低于正常对照组。说明T2As对损伤的黑质-纹状体通路具有修复和一定的保护作用，对PD损伤侧的多巴胺能神经细胞具有延缓死亡、增加黑质-纹状体DA的合成及释放，减慢DA分解速度，可能在一定程度保护了损坏的DA能神经细胞。

神经组织由神经元和神经胶质细胞组成。在神经胶质细胞中，星形细胞数量最多,分布最广。星形细胞广泛分布于中枢神经系统的灰质和白质，具有神经胶质细胞的大部分功能，如：支持、修复与再生、吞噬与保护、运输营养、参与构成血脑屏障、摄取化学递质和分泌功能等。星形胶质细胞支持、引导神经元，并增强神经元的存活，促进神经元之间形成突触连接。星形细胞又可分为T1As和T2As两种。在LPS(一种位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的类脂多糖类物质，可刺激炎症反应发生)的刺激下，他们观察到静息星形胶质细胞转变为T1As，后者可以产生大量的炎症因子。另一方面，T2As可由缺氧所诱导，在卒中脑组织附近分泌支持神经元生长，保证神经元健康及存活的物质。星形胶质细胞具有合成和分泌多种细胞因子的功能,包括可扩散的神经营养因子和非扩散的神经元支持物质,具有长期营养神经元、短暂刺激轴突生长等作用。分泌的脑源性生长因子、纤维粘连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)、层粘连蛋白、一氧化氮(NO)、胶质细胞源性生长因子等，虽然具体保护的分子机制不清楚，但这些营养因子能够使DA能神经元减少神经毒性物质的损伤，对DA能神经元的营养、再生和分化的重要作用已在大量实验中得到证实。

近年来，许多研究自由基生成和氧化应激促进了PD的发展，DA自身氧化可产生毒性代谢产物H2O2，与铁作用后产生具有高毒性自由基，研究显示PD患者黑质部分的过氧化物含量较多，受此氧自由基的影响变性的核酸及蛋白变性的数量明显高于健康组，推测DA能神经元暴露于大量活性氧致使DA能神经元选择性丢失，而星形胶质细胞可以产生谷胱甘肽过氧化物酶，它的作用可以阻止过氧化氢转化为高毒性的羟自由基来达到抗氧化应激而发挥重要神经保护作用，这种保护作用对易受氧化应激的黑质DA能神经元来说尤为重要。研究显示[5,6]晚期PD大鼠黑质部分含谷胱甘肽过氧化物酶阳性的星形胶质细胞密度显著低于健康对照组，体外培养神经元细胞的过程中也发现星形胶质细胞可以保护神经元免受过氧化物诱导损伤。其作用机制可能是通过ATP依赖转运体，NMDA受体所介导。所以推测星形胶质细胞的抗氧化应激机制参与PD神经保护作用。此外，在DA能神经元附近，DA自身氧化代谢产生的毒性氧自由基会对DA能神经元造成损伤，星型胶质细胞其表达的单胺氧化酶B(MAO-B)和儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)对DA的作用代谢而保护仍旧存活的神经元，星型胶质细胞还可以大量摄取细胞外的兴奋氨基酸减少其对黑质的毒性作用以起到保护神经元的目的[7]。但是，星形胶质细胞在某些刺激因素的作用下也可能通过释放一些促炎症因子[8,9]，如一氧化氮、肿瘤坏死因子-α等炎性因子对多巴胺能神经元造成损伤而推动帕金森病的发生和发展。

综上所述，本实验研究发现移植星形胶质细胞后的PD大鼠一段时间后行为学明显改善，脑内单胺类神经递质含量上调明显，提示星形胶质细胞在PD的早期阶段，在一定程度保护了黑质-纹状体中受损的DA能神经细胞，保护作用是占主导作用。但星形胶质细胞在颅内后期分泌的神经递质，以及是否可以定向分化为具有其他生理学的神经元，这些对DA能神经元的具体作用仍不清楚，所以，我们进一步研究PD的不同时期星形胶质细胞的确切作用机制，对于治疗帕金森病有着重要的意义。