右美托咪定调节MAPK/ERK-CREB通路对大鼠海马神经元凋亡的保护作用

朱建坡， 梁 冰

神经系统疾病常发生于中枢神经、周围神经、植物神经系统，主要以运动、感觉和植物神经功能障碍为主要症状的疾病[1,2]。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路与神经系统性疾病密切相关，抑制MAPK信号通路可以减少海马神经元损伤和凋亡[3,4]。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一种α-2肾上腺素能受体激动剂，研究表明，DEX可减轻大鼠慢性神经病理性疼痛，抑制MAPK、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphoryltion of extracellular regulatory protein kinases，pERK)、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphoryltion of cAMP response element binding protein，pCREB)表达，推断DEX通过调控MAPK/ERK-CREB通路对海马神经元凋亡起保护作用[5]。本实验通过对大鼠构建癫痫持续状态(status epilepticus，SE)模型机构建立一种神经系统疾患，观察DEX对SE大鼠行为及MAPK/ERK-CREB通路的影响，以初步探究DEX对SE大鼠海马神经元凋亡保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Sprague-Dawley SPF级雄性大鼠40只，6～8周龄，体重200 g左右，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供，动物许可证号:2016PS260K。饲养条件：温度(22±2)℃，湿度40%～70%，每笼5只，自由摄食饮水，常规饲养1 w进行实验。本研究对于大鼠处理均符合实验动物福利与伦理委员会原则。

1.2 试剂及仪器 DEX(国药准字H20090248)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；Nissl染色试剂盒(货号：WLA128)购自万类生物有限公司，TUNEL试剂盒(货号：C1086)购自碧云天生物技术研究所；GAPDH抗体(货号：ab181602)、p-ERK抗体(货号：ab79483)、p-CREB抗体(货号：ab220798)、caspase-3抗体(货号：ab13847)、Bax抗体(货号：ab32509)、Bcl-2抗体(货号：ab182858)均购自美国Abcam公司；毛果芸香碱(货号：MB5259)购自美仑生物有限公司；氯化锂(货号：L1110)、阿托品(货号：AT100)购自美国Spectrum公司；地西泮(货号：BZ2886)购自上海恪敏生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的二抗(货号：BHR101)购自北京博尔西科技有限公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒(货号：P0010S)购自上海碧云天公司；蛋白电泳及电转移装置(型号：AU5800)购自北京市六一仪器厂；酶联免疫分析仪(型号：EVO75)购自澳大利亚Techan公司；超低温冰箱(型号：MDF-U32V)购自美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠SE模型构建[6]及分组 大鼠SE模型构建：大鼠腹腔注射3 mmol/kg 氯化锂，24 h后同一部位注射50 mg/kg毛果芸香碱，观察大鼠行为，根据癫痫发作Racine分级进行判断，大于4级，表明癫痫模型点燃成功。发作持续15 min后腹腔注射1 mg/kg阿托品，40 min后给予10 mg/kg地西泮腹腔注射直至发作终止从而进行控制。将大鼠随机分为正常对照组、阳性对照组、SE组、SE+DEX组，每组各10只。SE模型构建成功后，SE+DEX组大鼠腹腔注射1 μmol/L DEX；SE组、正常对照组腹腔注射同量0.9%氯化钠液；阳性对照组大鼠腹腔注射1 μmol/L苯巴比妥，药物干预24 h后留取标本。根据改良后Racine分级[7]：正常状态，0级；出现双目紧闭，面部细纤维肌束发生颤动(如耳朵和胡须等部位)，伴随吸气动作,1级；出现点头频率，面部肌束颤动明显,2级；前肢单肢发生抽搐,3级;前肢均发生阵挛，身体无直立,3.5级；前肢均发生阵挛，身体直立，4级；身体强直，伴随肢体倒向一侧，4.5级；出现强直阵挛，身体直立且背部倒地，5级。

1.3.2 动物行为学观察 给药后，对所有大鼠按Racine评分标准分别进行评分，每20 min作为一个评分时间点，连续观测，监测120 min，记录并计算各组大鼠Racine评分。

1.3.3 样品采集 给药24 h后，每组随机抽取5只腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，采用20 ml生理盐水和4%多聚甲醛40 ml经心脏灌注，取脑后采用4%多聚甲醛浸泡过夜，大脑标本在4%多聚甲醛固定24 h进行常规脱水、透明、石蜡包埋，制备海马组织蜡块置于4 ℃冰箱保存。用石蜡切片机作冠状切面连续切片，切片厚度约为4 μm，主要用于Nissl法和TUNEL法检测。另将每组剩余5只大鼠常规麻醉后，迅速断头取脑组织，在4 ℃条件下钝性分离大鼠双侧海马组织，迅速置于液氮罐中保存，用于Western blot检测。

1.3.4 Nissl法检测细胞损伤 将1.3.3中制备石蜡切片于二甲苯、不同浓度乙醇中浸泡，1%甲苯胺蓝染色40 min，后分色，脱水至透明后，封片，最后于显微镜下观察并对尼氏阳性的细胞进行计数。

1.3.5 TUNEL法检测细胞凋亡 将1.3.3中制备的石蜡切片于二甲苯、不同浓度乙醇中浸泡5 min后，用蛋白酶K室温消化1 h后，按TUNEL试剂盒说明书将切片进行染色、终止反应、封片等，于荧光显微镜下观察细胞凋亡数目。经TUNEL染色的阳性细胞呈棕黄色或棕褐色。

1.3.6 Western blot法检测大鼠海马组织中MAPK/ERK-CREB通路相关蛋白、凋亡相关蛋白表达 从液氮罐中取出海马组织，然后按照1∶5(wt/vol)加入500 μl细胞裂解液用玻璃研磨器研磨海马组织，裂解30 min后提取组织蛋白，离心取上清液即总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度后，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后加入一抗(MAPK、pERK、pCREB、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH抗体，1∶1500)，4 ℃孵育过夜，次日洗膜后加二抗(1∶5000)室温孵育2 h，TBST洗膜，加ECL发光液，在凝胶成像系统中拍照。

2 结 果

2.1 各组大鼠的行为学观察 与正常对照组相比，SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠Racine分值显著增加(P<0.05)，与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠Racine分值显著降低(P<0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠Racine分值

与正常对照组比较*P<0.05；与SE组比较#P<0.05

2.2 各组大鼠海马神经元损伤及凋亡情况

2.2.1 细胞损伤结果 正常对照组大鼠海马区神经元边缘清晰，排列整齐，胞浆中可见尼氏小体；SE组大鼠海马区神经元缺失严重、排列松散，胞浆深浅不一，核仁消失或不明显；阳性对照组、SE+DEX组，神经元缺失减少，排列较规律(见图1)。对大鼠海马神经元计数分析结果显示，与正常对照组相比，SE组、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马神经元数显著减少(P<0.05)；与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马神经元数显著增加(P<0.05)(见表2)。

2.2.2 细胞凋亡结果 SE组、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马区神经椎体细胞固缩。TUNEL阳性细胞计数分析结果显示，与正常对照组相比，SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马区棕褐色阳性细胞显著增加(P<0.05);与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马区棕褐色阳性细胞显著减少(P<0.05)(见图2、表3)。

2.3 各组大鼠海马组织中MAPK/ERK-CREB通路相关蛋白表达结果比较 与正常对照组相比，SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表达量显著降低(P<0.05)(见图3、表4)。

2.4 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达结果比较 与正常对照组相比，SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)；与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)(见图4、表5)。

组别例数海马神经元数量(个)正常对照组SE组阳性对照组SE+DEX组5555145.32±5.1262.14±4.01*73.12±4.12*#76.45±3.98*#

与正常对照组比较*P<0.05；与SE组比较#P<0.05

组别例数海马区凋亡细胞数量(个)正常对照组SE组阳性对照组SE+DEX组55551.32±0.0215.32±1.13*12.24±1.10*#11.86±1.08*#

与正常对照组比较*P<0.05；与SE组比较#P<0.05

表4 各组大鼠海马组织中MAPK/ERK-CREB通路相关蛋白表达结果

与正常对照组比较*P<0.05；与SE组比较#P<0.05

表5 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达结果

与正常对照组比较*P<0.05；与SE组比较#P<0.05

a：正常对照组；b：SE组；c：阳性对照组；d：SE+DEX组

图1 各组大鼠海马神经元Nissl染色图

a：正常对照组；b：SE组；c：阳性对照组；d：SE+DEX组

a：正常对照组；b：SE组；c：阳性对照组；d：SE+DEX组

图3 各组大鼠海马组织中p-ERK、p-CREB蛋白表达图

a：正常对照组；b：SE组；c：阳性对照组；d：SE+DEX组

图4 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达图

3 讨 论

神经性疾病发生会引起患者瘫痪、共济失调、肌萎缩侧索硬化、头痛、反射异常、肌萎缩、排尿、排粪、性功能障碍等症状。SE属于神经性疾病，是由多种病因共同引起的一种慢性脑部疾病[8]。随着社会发展、饮食习惯变化，神经性疾病的发病率逐年升高，严重影响人们的身体健康和生活质量[9]。临床上对于神经性疾病治疗，多以药物控制为主，但目前药物对智力、运动功能、情绪等方面造成严重的副作用，因此找寻找新的药物对神经性疾病的治疗具有重要意义。DEX主要是作用于中枢神经及周围神经系统，有镇静、镇痛、抑制交感神经活动等作用，临床多与镇静、镇痛药物联合使用进行麻醉[10]，最近有研究表明DEX对SE有良好的治疗作用[11]。本研究通过观察各组大鼠的行为学发现，与正常对照组相比，SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠Racine分值显著增加；与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠Racine分值显著降低，提示SE大鼠模型构建成功，DEX对SE大鼠有一定治疗作用。SE是一种以中枢神经功能障碍为特征的脑部疾病，由于海马区的脑神经元过度兴奋，持续频繁的兴奋会造成脑内神经递质等化学物质发生病变所引起的。丁秀芳等[12]研究发现，SE可导致海马区神经元损伤。本研究发现，与正常对照组相比，SE组、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马区神经元缺失严重，核仁消失或不明显，神经椎体细胞固缩，大鼠海马神经元数显著减少，海马区棕褐色阳性细胞显著增加，提示SE发生会引起海马神经元数减少，海马神经元凋亡增加。研究表明，DEX可以抑制海马神经元损伤[13]。本研究发现，与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马神经元数显著增加，海马区棕褐色阳性细胞显著减少，提示DEX可以抑制海马神经元数减少和海马神经元凋亡。

caspase-3是一种剪切酶，在细胞凋亡中不可缺失，Bax属于Bcl-2家族，是凋亡促进基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax可以与Bcl-2形成二聚体结构[14]。早期研究发现，Bax/Bcl-2比例可以表明细胞凋亡的强弱，本研究发现，与正常对照组相比，SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达量显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著降低，提示caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡密切相关。研究表明，降低海马区Bax、caspase-3表达，提高Bcl-2表达，DEX可以抑制AD大鼠海马区内细胞凋亡[15,16]。本研究发现，与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达量显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著升高，提示DEX可能通过抑制caspase-3、Bax表达，促进Bcl-2蛋白表达，抑制细胞凋亡。

MAPK家族主要作用是将细胞外信号传导到细胞内部与ERK1/2在脑部海马区发挥重要作用[17]。ERK通路可以激活CREB使其发生磷酸化，调控神经元发育、兴奋、凋亡等过程[18]。本研究发现，与正常对照组相比，SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表达量显著升高，提示MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表达与SE发生密切相关。研究表明，抑制MAPK信号通路对海马神经元毒性损伤起到一定的保护作用[19]。本研究发现，与SE组相比，阳性对照组、SE+DEX组大鼠海马组织中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表达量显著降低，提示DEX可以抑制MAPK、p-ERK、p-CREB表达，推测DEX可能通过抑制MAPK/ERK-CREB通路抑制海马神经元凋亡，对海马神经元损伤发挥保护作用。

综上所述，DEX可能通过抑制MAPK/ERK-CREB通路抑制海马神经元凋亡，对其发挥保护作用。需进一步研究DEX调控MAPK/ERK-CREB通路治疗神经性疾病有效性及其调控其他信号通路的可能作用机制。