血清mir-210、HIF-1α水平与动脉瘤性蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血的关系

王 娜， 卞玉杰， 田继新

动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)是一种非常严重的脑血管疾病，其病情凶险，易并发迟发性脑缺血(delayed cerebral ischemia，DCI)，严重影响患者神经功能恢复。近年来，aSAH后DCI发病率越来越高，是导致aSAH患者残疾、死亡的主要原因[1]。因此，早期预测aSAH后DCI发生显得至关重要。

研究发现微小RNA(microRNA，miRNA)参与调节脑卒中的各个环节，在其发生、发展过程中具有重要作用[2]。微小RNA-210(microRNA-210，mir-210)是miRNA中重要一员，能够促进血管新生，其水平变化与颈动脉狭窄程度相关[3]。而缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是机体缺氧时重要的核转录因子，其能通过调控mir-210表达促进疾病发展[4]。

为探讨血清mir-210、HIF-1α水平在aSAH后DCI发生中的作用，本研究通过测定260例aSAH患者血清mir-210、HIF-1α水平，用于评估两者与aSAH后DCI发生可能关系，并探讨血清mir-210、HIF-1α水平对aSAH后DCI发生的预测价值。结果如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年10月-2019年10月在本院神经外科诊治的260例aSAH患者作为研究对象，其中男性114例，女性146例；年龄30～70岁，平均年龄(55.27±12.81)岁。纳入标准：(1)均符合aSAH相关诊断标准[5]；(2)临床资料齐全；(3)均为初次发病；(4)发病至入院时间<24 h。排除标准：(1)非动脉瘤破裂所致蛛网膜下腔出血者；(2)入院7 d内死亡；(3)伴有严重肝、肾功能不全者；(4)伴有颅内感染或血液系统疾病者。本研究符合本院伦理委员会要求，且患者或家属签署《知情同意书》。

1.2 方 法

1.2.1 DCI诊断标准及分组 DCI诊断标准[6]：(1)发病4 d后出现肢体瘫痪、意识下降、失语等神经功能缺损体征；(2)经电子计算机断层扫描(computed tomography，CT)排除颅内再出血、脑水肿、脑积水等因素；(3)经复查头部CT可见新的梗死灶；(4)上述症状至少持续1 h。根据aSAH后DCI发生情况将260例患者分为未发生DCI组(n=181)、发生DCI组(n=79)。

1.2.2 临床资料收集 护理人员收集两组患者性别、年龄、发病至入院时间、高血压、吸烟(吸烟≥1支/d，且至少持续1 y者，即为吸烟)、饮酒(乙醇摄入量≥50 g/d，且至少持续1 y者，即为饮酒)、动脉瘤大小、动脉瘤位置(前循环或后循环)、Hunt-Hess分级(分为1级、2级、3级、4级、5级)、Fisher分级(分为1级、2级、3级、4级)及治疗方式(手术夹闭或血管内栓塞)等资料。

1.2.3 血清mir-210、HIF-1α水平测定 收集患者入院时肘静脉血3 ml，3000 r/min离心10 min，抽取血清保存于-70 ℃低温冰箱中。血清mir-210水平使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)进行测定。按照TRIzol试剂盒(货号：15596018，购自武汉纯度生物科技有限公司)说明书从血清中提取总RNA，以紫外分光光度计检测其浓度及纯度，并依据PrimeScriptTMRT试剂盒(货号：RR055A，购自北京冬歌博业生物科技有限公司)说明书合成cDNA链。以U6为对照进行扩增，引物均是根据GenBank数据库提供的核酸序列进行设计，mir-210引物为：上游5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCGGC-3’，下游5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’；U6引物为：上游5’-CTCGCTTCGGCACCACAAAT-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGTCAT-3’。反应条件为：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共40个循环。每个样本均重复3次，并用2-△△Ct法计算血清mir-210表达量。血清HIF-1α水平使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进行测定，测定方法按试剂盒(货号：X-EL-H1277c，购自上海江莱生物科技有限公司)说明书进行。

采用Pearson检验分析aSAH患者血清mir-210水平与HIF-1α水平的相关性；采用多因素Logistic回归分析影响aSAH后DCI发生的危险因素；并使用ROC曲线分析血清mir-210、HIF-1α水平对aSAH后DCI发生的预测价值。均以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者临床资料比较 两组患者性别、年龄、发病至入院时间、高血压、吸烟、饮酒、动脉瘤大小及治疗方式相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；两组患者动脉瘤位置、Hunt-Hess分级及Fisher分级情况相比，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

2.2 两组患者血清mir-210、HIF-1α水平比较 发生DCI组患者血清mir-210、HIF-1α水平均明显高于未发生DCI组患者(P<0.05)(见表2)。

2.3 aSAH患者血清mir-210水平与HIF-1α水平相关性 aSAH患者血清mir-210水平与HIF-1α水平呈正相关(r=0.693，P<0.05)(见图1)。

2.4 影响aSAH后DCI发生的危险因素分析 以aSAH后是否发生DCI为因变量，以动脉瘤位置、Hunt-Hess分级≥3级、Fisher分级≥3级及血清mir-210、HIF-1α高水平为自变量进行Logistic回归分析，变量赋值(见表3)。结果显示Hunt-Hess分级≥3级、Fisher分级≥3级及血清mir-210、HIF-1α水平是影响aSAH后DCI发生的独立危险因素(P<0.05)(见表4)。

2.5 血清mir-210、HIF-1α水平对aSAH后DCI发生的预测价值 血清mir-210水平联合HIF-1α水平预测aSAH后DCI发生的曲线下面积高于血清mir-210水平(Z=2.018，P=0.044)、HIF-1α水平(Z=3.338，P=0.001)单独预测，其预测敏感度为83.33%，特异度高达94.44%(见表5、图2)。

表1 两组患者临床资料比较

与未发生DCI组患者相比*P<0.05

表2 两组患者血清mir-210、HIF-1α水平比较

与未发生DCI组患者相比*P<0.05.

表3 变量赋值

表4 影响aSAH后DCI发生的危险因素分析

表5 血清mir-210、HIF-1α水平对aSAH后DCI发生的预测价值

图1 aSAH患者血清mir-210水平与HIF-1α水平相关性

图2 血清mir-210、HIF-1α水平预测aSAH后DCI发生的ROC曲线

3 讨 论

DCI是aSAH最主要的并发症，易导致患者局部脑组织缺血或坏死，发生不可逆缺血性神经功能损害，对患者身心健康造成严重影响。相关研究证实[7]，DCI具有较高的致残率和病死率，且其发生与aSAH患者病情恢复有关。因此，寻找可靠有效的血清标记物早期预测aSAH后DCI发生情况具有一定临床价值，以期为早期防治aSAH后DCI提供有力依据。

miRNA是一类单链非编码小RNA，大多数miRNA可能通过调控血管内皮生长因子而参与大脑缺血、缺氧过程[8]。mir-210是在缺氧环境下表达水平较稳定的miRNA之一，位于人染色体11p15.5，其在促进脑缺血后血管新生过程中发挥重要作用[9]。Wang等[10]研究发现，急性脑梗死患者血清mir-210表达水平明显高于正常对照组，且血清mir-210表达水平可作为诊断急性脑梗死的有效指标。本研究结果发现，发生DCI组患者血清mir-210水平远高于未发生DCI组患者，与Wang等[10]研究结果类似，提示血清mir-210水平升高可能与aSAH后DCI发生有关。且相关研究报道[11]，miRNA可作为HIF-1α的调节因子，在转录后水平HIF-1α的表达中具有重要调节作用。而HIF-1α位于人14号染色体q21-24区，通常在低氧环境中存在，其下游靶基因血管内皮生长因子参与血管生成、细胞能量代谢等多个生理、病理过程[12]。研究发现HIF-1α异常表达参与缺血、缺氧性疾病的发展过程[13]。陈锦艳等[14]研究报道，脑出血组大鼠血清HIF-1α水平远高于正常组大鼠。此外，郭异之等[15]研究发现，重型颅脑损伤预后不良患者血清HIF-1α水平明显高于预后良好组患者，其水平变化可作为近期预后的早期预测指标。本研究中，与未发生DCI组患者相比，发生DCI组患者血清HIF-1α水平明显升高，与郭异之等[15]研究相似，提示血清HIF-1α水平升高可能参与aSAH后DCI发生。

本研究结果还发现，aSAH患者动脉瘤位置、Hunt-Hess分级及Fisher分级情况均可能与DCI发生有关。Pearson检验分析显示，aSAH患者血清mir-210水平与HIF-1α水平呈正相关，提示血清mir-210、HIF-1α水平可能共同参与aSAH发生、发展，并可能在DCI发生中发挥重要作用。多因素Logistic回归分析显示，Hunt-Hess分级≥3级、Fisher分级≥3级及血清mir-210、HIF-1α高水平均是影响aSAH后DCI发生的独立危险因素，提示除Hunt-Hess分级≥3级、Fisher分级≥3级因素外，临床测定血清mir-210、HIF-1α水平可能有利于预测aSAH后DCI发生情况，对早期防治aSAH后DCI具有积极作用。此外，本研究ROC曲线分析结果显示，血清mir-210、HIF-1α水平预测aSAH后DCI发生的曲线下面积分别为0.879、0.822，提示两者均可作为预测aSAH后DCI发生的指标，但预测敏感度均较低，且特异度也不高，临床单独预测具有一定局限性。因此，本研究进一步使用血清mir-210水平联合HIF-1α水平预测aSAH后DCI发生情况，结果显示曲线下面积为0.940，均高于两者单独预测，且特异度高达94.44%，提示血清mir-210、HIF-1α水平联合预测aSAH后DCI发生的应用价值高于两者单独使用。

综上所述，本研究血清mir-210、HIF-1α水平升高可能与aSAH后DCI发生有关，检测血清mir-210、HIF-1α水平有望作为评估aSAH后DCI发生的重要指标，尤其是两者联合可能价值更高，临床应密切关注aSAH患者血清mir-210、HIF-1α水平变化，以期为早期防治DCI提供帮助。临床上影响aSAH后DCI发生的因素较多，可能会影响本研究结果准确性，应扩大样本量继续研究。