咪达唑仑对人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的抑制效应及机制

焦晶华,王宇恒,孙晓峰

(沈阳医学院附属中心医院 麻醉科,辽宁 沈阳,110024)

肺癌是世界范围内较为常见的癌症，其发病率和致死率均居首位，严重危害人类的健康[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%,手术仍是治疗NSCLC的首选方案。NSCLC术后复发及转移十分常见，通常需要配合化疗，但化疗产生的副作用和效果的不确定性是影响患者生存质量的主要原因。咪达唑仑是γ-氨基丁酸A(GABAA)受体激动剂，广泛用于术前镇静。既往研究[2]揭示咪达唑仑等麻醉药物可能影响癌细胞的生物活性，具有作为潜在的癌症治疗性药物的可能性，作者前期体外研究发现咪达唑仑可以显著抑制A549细胞的增殖并诱导其凋亡，但咪达唑仑对肺癌细胞的体内作用及机制尚不清楚。本研究分析咪达唑仑对人NSCLC-A549细胞的体内研究结果，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 材料

人肺腺癌A549细胞;BALB/c雄性裸鼠20只,6～8周龄，体质量18～22 g,无特定病原体(SPF)级环境饲养。RPMI 1640培养基等购自Hyclone公司;咪达唑仑购自江苏恩华药业有限公司;细胞核和细胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、Ki-67抗体、SDS.PAGE凝胶配制试剂盒均购自碧云天生物工程有限公司;二甲基亚砜、β-actin抗体购自Sigma公司。

1.2 动物模型建立

将A549细胞于DMEM/Ham′s F-12培养基中培养,0.25%胰酶消化传代;取对数生长期的细胞消化，离心，收集底部细胞，将细胞浓度调整为1.0×107/mL,抽取细胞悬液0.2 mL接种于BALB/c裸鼠腋部皮下，构建裸鼠肺癌移植瘤模型。

1.3 分组及给药

接种后密切观察裸鼠生长情况和移植瘤变化，待移植瘤长径大于5.0 mm时判定为成瘤。共12只裸鼠成瘤成功，按移植瘤体积随机分为咪达唑仑组与对照组，每组6只。咪达唑仑组腹腔注射0.5 mL(0.8 mg/kg)咪达唑仑，每日同一时间给药1次，连续20 d;对照组腹腔注射0.5 mL生理盐水，用法同咪达唑仑组。连续记录裸鼠体质量，肿瘤体积。20 d后处死裸鼠，剥离移植瘤并称湿重，石蜡包埋，切片以备免疫组化(IHC)分析用。留取部分新鲜肿瘤组织，研磨用于提取蛋白，苏木精-伊红染色法(HE染色)观察肿瘤病理学变化;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-咪达唑仑组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。移植瘤体积按公式V=(π/6)×(L×W2)计算，其中V指肿瘤体积，L指肿瘤长径,W指肿瘤宽径。

1.4 IHC检测移植瘤组织中Ki 67的表达

采用兔两步法进行IHC染色，以0.01 mol/L PBS作为阴性对照;20%羊血清孵育;添加一抗，孵育2 h;PBS冲洗;添加Envision;PBS冲洗;滴加3′3-DAB,10 min后显微镜观察至组织显色;随机采集5个不重叠视野(放大倍率100倍)，导入MIQAS免疫组化分析系统，棕黄色颗粒为Ki-67阳性表达，其定位于细胞核[3],计数Ki-67阳性细胞和总细胞[4],阳性细胞率(%)= Ki-67阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5 Western-blot检测信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)的表达

磨碎移植瘤组织，加入裂解液静置30 min,离心，收集上清，采用分光光度计测定，绘制标准曲线，电泳，蛋白条带转移至硝酸纤维素膜，抗STAT3抗体(1∶200)杂交，洗膜,37 ℃二抗(1∶5 000)杂交2 h。显影，拍照。

1.6 统计学分析

应用SPSS 20.0统计软件进行分析，连续变量用均数±标准差表示，以α=0.05为检验水准，双尾检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 咪达唑仑对移植瘤生长的抑制作用

20 d时，咪达唑仑组移植瘤体积为(0.52±0.12) cm3,显著小于对照组的(0.84±0.25) cm3(P<0.01);20 d时，咪达唑仑组移植瘤质量为(0.51±0.21) g,显著低于对照组的(0.79±0.31) g (P<0.05)。20 d时咪达唑仑组抑瘤率为33.3%。见图1。

2.2 HE染色结果

HE染色结果显示，对照组瘤细胞排列紊乱，核异型性明显，染色深，核分裂像增多。咪达唑仑组可见瘤细胞核浓缩，排列松散，胞质呈嗜酸性。见图2。

2.3 TUNEL染色

对照组瘤细胞凋亡指数为(6.87±2.35) %,咪达唑仑组瘤细胞凋亡指数为(14.58±4.01) %,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 移植瘤组织Ki-67的变化

咪达唑仑组Ki-67阳性细胞率为(55.44±6.16) %,低于对照组(81.34±4.13) %,差异有统计学意义(P<0.05)。

A:对照组;B:咪达唑仑组。

图2 对照组与咪达唑仑组HE染色结果(放大倍数100倍)

A:对照组;B:咪达唑仑组。

图3 对照组与咪达唑仑组瘤细胞凋亡情况(放大倍数400倍)

2.5 裸鼠肺癌移植瘤肿瘤组织STAT3蛋白的表达

采用Western-blot技术检测2组肿瘤组织中STAT3蛋白的表达，与对照组相比，咪达唑仑组STAT3蛋白水平显著下调(P<0.05)。见图4。

3 讨 论

研究[5]提示麻醉药物可能具有潜在的抗肿瘤效应，作者前期的体外研究已发现咪达唑仑可以显著抑制肺癌细胞的增殖，诱导其发生凋亡，但是其在体内模型的效应尚不清楚。为了评价咪达唑仑在体内对肺癌组织的作用效果，本研究采用国际上较为常用且相对简单的移植瘤BALB/c裸鼠模型加以证实[6],BALB/c裸鼠腋部皮下可以为肺癌的生长提供良好的介质，将A549细胞直接接种在此处有利于肺癌组织的生长;实验中设定的咪达唑仑给药剂量0.8 mg/kg是参照文献[7]及多次预实验后确定。

本研究结果显示，咪达唑仑干预后,A549肺癌移植瘤质量和体积得到了显著抑制，计算后抑瘤率为33.3%。HE染色可见对照组移植瘤细胞排列紊乱，核异型性明显，染色深，核分裂像增多;咪达唑仑组可见瘤细胞核浓缩，排列松散，胞质呈嗜酸性。这一结果表明在形态学上，咪达唑仑对A549肺癌移植瘤BALB/c裸鼠肿瘤组织有明显的抑制作用。

IHC技术在肿瘤诊断和鉴别诊断中具有重要作用，准确率可达50%～75%[8-9]。在IHC技术中，通常以Ki-67作为细胞增殖的一种标记[10],Ki-67即Ki-67抗原，编码人类Ki-67蛋白的基因，通常可以在细胞周期的G1、S、G2、M期表达，但在G0期缺如。作为一种与细胞增殖相关的核蛋白，与核糖体RNA转录相关，参与许多肿瘤细胞分化、浸润和转移的过程[11-17]。本研究利用IHC技术检测裸鼠移植瘤组织中Ki-67的表达，发现咪达唑仑可以显著抑制肺癌移植瘤细胞增殖，诱导移植瘤细胞凋亡，证实咪达唑仑可以在体内抑制人肺癌细胞的生长。

STAT家族是潜在的胞质转录因子标记，可以为许多细胞因子和生长因子提供转导。STAT3是庞大的STAT家族中的主要成员之一，目前已知STAT3可以在多种肿瘤疾病或免疫性疾病中被激活。作者前期的体外研究[2]发现，咪达唑仑可以影响STAT3相关通路的正常表达，从而发挥抗肺癌的效应。本研究仍选取STAT3作为靶向分子标记，分析咪达唑仑体外抗肿瘤细胞的相关机制，与前期研究结果一样，作者发现咪达唑仑可以显著下调STAT3蛋白水平。

本研究利用体外建模证实咪达唑仑可以抑制A549移植瘤，但本研究也有一定的局限性，如利用单一的给药剂量(0.8 mg/kg)尚不足以分析咪达唑仑干预肺癌的剂量效应关系;本研究的样本量相对较小;本研究仅建立了移植瘤一种模型，对于转移瘤的效应还有待于进一步的证实;本研究设计的对照组为生理盐水，咪达唑仑抗肺癌的效应是否优于已知的抗肿瘤药物同样有待于进一步研究。

综上所述，咪达唑仑可以影响STAT3的表达，从而显著抑制A549肺癌移植瘤BALB/c裸鼠肿瘤细胞生长。