腐乳生产过程中细菌污染的状况与分析

廖新浴，陈信贤，刘东红，叶兴乾，尹源明，周建伟,3，谢小本，丁 甜

(1. 浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058; 2. 浙江大学 馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058; 3. 浙江大学 宁波理工学院，浙江 宁波 315100；4. 绍兴咸亨食品股份有限公司，浙江 绍兴 312000)

腐乳是一种传统的中国豆类发酵食品，是由微生物发酵生产的、类似奶酪的产品，具有独特的风味，容易被消化，并且具有较高的蛋白质含量[1]。腐乳的生产流程一般包括豆腐切块、酸泔水点浆、接种、发酵、腌制和加汤料几大步骤。尽管在发酵培养中使用纯培养物，但豆腐生产过程在非无菌开放条件下进行，导致在生产过程中细菌污染的可能性很高。另外，大部分腐乳中虽然含有NaCl (5%～15%)和乙醇(1%～7%)，可以防止病原体存活或生长[1]，但是对于可形成芽孢的芽孢杆菌属(Bacillusspp.)和梭菌属(Clostridiumspp.)来说，由于芽孢对环境压力的耐受能力比较强，比如对盐有耐受性[2]，仍无法完全抑制它们的存活，从而对腐乳产品的安全性造成了潜在风险[3]。

本文中，笔者将以红腐乳的生产过程为例，对各个生产环节的细菌进行分离和鉴定，并分析腐乳生产过程中可能存在的食源性致病菌和腐败菌，以期对腐乳生产工艺优化和安全性问题提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

细菌DNA提取试剂盒，Personalbio公司；NaCl和甘油，国药集团化学试剂有限公司。

2720 PCR扩增系统，Applied Biosystems公司；3730XL型DNA测序分析仪，ABI PRISM公司。

1.2 样品采集

该实验的腐乳半成品来自于绍兴的一家豆腐乳工厂，从8个生产步骤中采集样品。这8个生产步骤包括：①豆腐原料；②酸泔水点浆过程;③培养发酵喷菌后;④白坯生长中期(7 d后);⑤白坯生长后期(14 d后);⑥腌制1 d后；⑦腌制4 d后；⑧添加红曲后与其他料之后。

1.3 菌种分离与鉴定

将腐乳样品使用研钵和研杵匀化，取5 g试样腐乳和45 mL无菌生理盐水匀浆。然后将样品用无菌生理盐水连续适当稀释并涂布到平板上培养2 d，挑取形态特征不同的单个菌落到液体培养基中培养24 h，并在平板上划线，将单个菌落接入液体培养基中，最后分离纯化菌种与甘油混合，冻存于-80 ℃。用细菌DNA提取试剂盒提取菌体DNA。对纯分离菌株进行16S rDNA基因序列分析。通用引物为27F (5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′)和1492R(5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′)。PCR反应是在2720 PCR扩增系统下运行并利用下列条件进行反应：98 ℃ 5 min预变性，其次26个周期的扩增过程包括98 ℃(20 s)、98 ℃(20 s)和72 ℃(7 min)，最后在72 ℃保持10 min。使用ABI PRISM 3730XL DNA测序分析仪进行延伸的最后一步。对PCR产物进行测序(Personalbio公司，上海)，所获得的序列与GenBank 数据库(美国国家生物技术信息中心)进行BLAST算法比对。

2 结果与讨论

2.1 红腐乳生产环节中细菌鉴定结果

红腐乳生产环节中细菌鉴定结果如表1所示。由表1可知：豆腐原料中存在的细菌主要是蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。豆腐是腐乳的生产原料，其蛋白质含量为6.0%～8.4%，含水量79%～87%[4]，pH为5.2～6.2[5]。由于其蛋白质、水含量高，具有偏中性pH，因此豆腐很容易被微生物污染[6]。在酸泔水点浆过程中，主要细菌菌株是金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，这一结果与周婷婷等[7]的研究结果一致，该研究也发现蜡样芽孢杆菌存在于凝乳豆腐的酸浆水中。接种过程中存在的主要细菌种类是枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。该步骤中的枯草芽孢杆菌(B.subtilis) 可能来自于接种剂，作为食品中的安全启动剂存在于随后的发酵过程中[8]。

发酵中期 (约7 d)主要存在蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)和吉氏库特菌(Kurthiagibsonii)；在发酵后期 (约14 d)主要存在乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)；腌制1 d后分离鉴定出的菌种包括阴沟肠杆菌和蜡样芽孢杆菌2种菌；而腌制4 d后，腐乳只存在阴沟肠杆菌一种菌种，这一结果与姚翔等[9]研究结果一致，随着腌制时间的延长，腐乳中食盐的作用会对芽孢杆菌有一定的抑制作用。而添加红曲后的腐乳中，菌种主要包括鲍曼不动杆菌、蜡样芽孢杆菌和吉氏库特菌3种。

表1 红腐乳生产环节中细菌鉴定结果

2.2 腐乳生产过程中所分离细菌的特性分析

2.1节中研究发现腐乳生产过程中存在的食源性致病菌为蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌和阴沟肠杆菌以及腐败菌如吉氏库特菌和乳酸乳球菌，对这些细菌的特性进行分析，结果如表2所示。由表2可知，腐乳生产安全性应该给予重视。蜡样芽孢杆菌是同时具有致病性和致腐性的微生物[10]，当蜡样芽孢杆菌在腐乳中达到106cfu/g时[7]，有可能会引起恶心、呕吐和腹泻的症状[11]。蜡样芽孢杆菌也能产生芽孢，具有耐热性、耐受冷冻和干燥的特点[11-12]，还能附着于食物接触表面(例如不锈钢工具和生产设备)并形成生物膜，并且在表面上积累[13]。粪肠球菌属于乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB )，但是它也是一种具有致病性和引起食品腐败的微生物[14]，能够引起心内膜炎、菌血症、泌尿、新生儿院内感染、中枢神经系统(CNS)、腹腔和盆腔感染等。像其他肠球菌一样，它也可以通过基因水平转移来传播抗生素抗性基因，从而增加全球耐药性问题[15]。恶臭假单胞菌被认为是自然环境和人体表面的广泛细菌污染物[16]。已知恶臭假单胞菌引起食物变质，并且某些种属可以分泌与发病相关的蛋白质，从而可引起尿路感染、败血症和胃肠道感染等疾病[17]。金黄色葡萄球菌是导致严重全球性后天感染的重要的人类病原体之一[18]，能产生葡萄球菌肠毒(SE)，从而引起葡萄球菌食物中毒(SFP)[19]。鲍曼不动杆菌具有致病性，可引起一系列严重感染病，如血流感染(BSI)等[20-21]，这与其具有的多药耐药性(MDR)有关，但是它很少会引起腹泻的症状[22]。吉氏库特菌可造成食物腐败，广泛分布于环境和农场的动物、粪便、土壤、地表水、肉类和冷藏后的肉和肉制品中[23]。 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)可以产生酸性物质，如乳酸链球菌肽 (Nisin)、Pediocin和其他细菌素[24]，这些细胞素主要抑制革兰氏阳性菌，而对大多数的革兰氏阴性菌没有抑制效果[25]，这可能是发酵前期的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌失去生长优势的原因[19]。而除了细菌营养体之外，一些细菌如蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌还能产生芽孢。由于芽孢的生存能力很强，不易消灭，而且孢子黏附能力使其能够在设备或生产线机器中残存，从而导致芽孢更难以被清除，都对食品安全性造成了潜在的威胁[26]。

表2 腐乳生产过程中所分离细菌的特性

3 结论

本文中，笔者研究发现腐乳生产过程中存在一些致病菌或者是腐败菌。腐乳生产过程中分离检测出的粪肠球菌、恶臭假单胞菌、吉氏库特菌、金黄色葡萄球菌和阴沟肠杆菌都属于食源性致病菌，因此需要引起对腐乳生产安全性的注意。有必要在前期生产过程中将污染细菌降低到最低范围，以保证后期发酵时的微生物安全。保证安全新鲜的豆腐原料是制作豆腐乳的关键控制点。应加强维持干净的生产环境、个人、贮藏等过程中的卫生管理。加强菌种管理，传统发酵不能够完全控制微生物活性，所以对菌种进行分离和纯化及妥善保藏都是有必要的。