HPLC-PAD法优化乌骨鸡活性肽分离纯化

白 芳，李映红，吴正治，黄飞娟,3

(1.深圳大学附属第一医院，广东 深圳 518035；2.深圳市老年医学研究所，广东 深圳 518020；3.中山大学附属第一医院，广东 广州 510080)

乌骨鸡(Black-Bone Silky Fowl,GallusgallusdomesticusBrisson)，是一种具有药用价值的鸡种。研究证明，乌骨鸡对各类虚症，如气虚、血虚、脾虚、肾虚和心虚等均有良好疗效[1-3]。乌骨鸡活性肽，即乌骨鸡肌肉蛋白通过一定优化工艺酶促水解后获得的具有较小分子量范围的多肽产物，分子量集中在3 000以下，其营养价值高、更易吸收[4-5]。乌骨鸡多肽内部普遍存在功能区，这些功能区的研究对于乌骨鸡活性肽临床价值的充分利用尤其重要。然而，乌骨鸡活性肽的分离纯化是研究其应用价值的基础。

目前用于乌骨鸡多肽的分离技术最为常见的有凝胶过滤色谱法和反相液相色谱法，常用的分离体系为甲醇和乙腈体系等[6-9]。根据多肽混合物进入分析级反相色谱柱时表现的极性和进入凝胶色谱柱时分子量的不同进行高效液相色谱(HPLC)的分离纯化[10]。反相色谱柱分离纯化效果一般较凝胶色谱柱好，但不能表现出多肽分子量通过色谱柱的前后次序；乙腈比甲醇分离效果好，但其价格昂贵[11]。在多肽的分离纯化中，一般将凝胶过滤色谱法和反相液相色谱法结合使用[12-13]。然而，根据这两种不同原理，选择不同流动相及其他参数等的各自分离条件及分离效果如何，并没有统一性。

为解决上述多肽分离纯化的共性问题，同时提供药用价值突出的乌骨鸡多肽的最佳分离条件，本研究中，笔者主要针对目前常用酶解工艺流程制备乌骨鸡活性肽，即木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对乌骨鸡肌肉蛋白进行充分酶解后，采用高效液相色谱(配置PDA全波长检测器)(HPLC-PDA)法对C18反相色谱柱(0.1%三氟乙酸或磷酸钠/甲醇/水体系)及TSKgel凝胶色谱柱(0.1%三氟乙酸/乙腈/水体系)的多肽分离条件分别进行优化，从流动相、物料比、流速、进样量、波长等方面进行探究，以出峰数为主，结合分离度、峰形、基线、信号等考察其分离效果。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

食品级木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，广州裕立宝科技有限公司；BCA蛋白检测分析试剂盒，美国Thermo公司；三氟乙酸、甲醇及乙腈为色谱纯，美国Sigma公司；NaOH及Na3PO4为国产分析纯，广东光华科技股份有限公司。

1.2 主要仪器

胶体磨，南通澳德精密机械公司；酶标仪，美国Thermo公司；岛津LC20 AD型高效液相色谱仪(配置PDA全波长检测器)、C18色谱柱Inertsil SOD-SP(5 μm,150 mm×4.6 mm)及凝胶色谱柱TSKgel G2000 SWxl (5 μm,300 mm×7.8 mm)，日本岛津公司。

1.3 乌骨鸡活性肽制备

选取江西省泰和乌骨鸡，体质量1.5 kg左右，雌雄各半(各10只)。复合酶解法制备乌骨鸡活性肽[14]。乌骨鸡肌肉蒸煮后，绞碎再加入胶体磨进一步磨碎，加入木瓜蛋白酶(4 000 U/g)和风味蛋白酶(2 000 U/g)进行酶解，其中酶解温度为55 ℃，酶解时间为3.5 h，沸水高温保持20 min进行灭酶，4 000 r/min离心15 min，分去上层油脂和下层沉淀物，取中层液，即为乌骨鸡活性肽溶液。按照BCA蛋白检测试剂盒的操作说明书进行蛋白定量，结果为1.597 mg/mL。

1.4 反相液相色谱法优化乌骨鸡活性肽分离条件

选择C18反相液相色谱法常用分离体系[15]：0.1%三氟乙酸或pH 6.0磷酸盐/甲醇/水体系，对乌骨鸡活性肽进行流动相物质配比、流速、进样量及波长的选择。首先，设置流动相体系为0.1%三氟乙酸/甲醇/水体系，甲醇体积分数设为20%、10%、8%、6%，对应流速依次为0.8、0.5、0.3和0.2 mL/min，同时选择进样量10 μL、柱温30 ℃、进样室温度4 ℃、测试时间30 min进行紫外全波长扫描。然后，流动相0.1%三氟乙酸/6%甲醇/水体系中更换三氟乙酸为磷酸盐缓冲液，调节磷酸盐缓冲液pH 至 6.0，进行紫外全波长扫描。此时，进样量分别设为5、10、50 μL，流速为0.2 mL/min，其他条件如上。

1.5 凝胶过滤色谱法优化乌骨鸡活性肽分离条件

TSKgel凝胶过滤色谱法进行乌骨鸡活性肽的分离[16]，首先选择甲醇/水体系进行分离优化，但优化效果不理想，更换为0.1%三氟乙酸/乙腈/水体系进行分离优化。采用0.1%三氟乙酸/15%乙腈/水均匀无梯度洗脱，进样量设为10 μL、流速0.5 mL/min、柱温30 ℃、进样室温度4 ℃、测试时间30 min进行紫外全波长扫描。然后，采用0.1%三氟乙酸/(15%～65%)或(10%～25%)乙腈/水体系均匀上升梯度洗脱30 min，同时设置不同流速或不同进样量进行优化，进行紫外全波长扫描。

1.6 数据处理

采用BCA蛋白检测试剂盒重复检测3次，外标法进行样品蛋白的定量。

2 结果与讨论

2.1 反相液相色谱法分离乌骨鸡活性肽的优化结果分析

2.1.1 反相液相色谱法最佳优化结果

图1 C18反相液相色谱法优化乌骨鸡活性肽的分离条件Fig.1 Optimizing isolation condition of peptides by C18 reversed-phase chromatography

三氟乙酸及磷酸盐作为缓冲液时，反相液相色谱法分离乌骨鸡活性肽的最佳分离情况如图1所示。由图1可知：在分离小分子多肽时，反相液相色谱法的实验优化结果为C18柱-0.1%三氟乙酸或pH 6.0磷酸盐/6%甲醇/水体系-流速0.2 mL/min-进样量5或10 μL-波长254 nm(10 μL)或220(5 μL)。此处，若结合分离度进行选择时，应选择C18柱-pH 6.0磷酸盐/6%甲醇/水体系-流速0.2 mL/min -进样量5 μL -波长220 nm，此时出峰距离相对较大，分离度和峰形均较好。

2.1.2 反相液相色谱法优化过程分析

本实验中，笔者主要考察C18色谱柱、缓冲液、甲醇、流速、进样量和波长等指标对乌骨鸡多肽分离效果的影响。在常用流动相0.1%三氟乙酸/甲醇/水体系中固定其他条件，变换甲醇浓度和流速大小，优化过程如表1所示。由表1可知：随着甲醇含量降低，流速降低，出峰数增加；当甲醇体积分数6%、流速0.2 mL/min时，分离效果最好。当把三氟乙酸换为磷酸盐(6%甲醇/水中加入4% 0.02 mol/L NaH2(PO4)3溶液，H3PO4调节pH至6.0)时，流速0.2 mL/min，当三氟乙酸或磷酸盐作为缓冲液时，出峰数基本一致，但三氟乙酸作为缓冲液时分离峰相对集中。进样量为50 μL时，220 nm处吸收较强，254 nm处分离效果较好；进样量为5 μL时，220 nm处分离效果较好，254 nm处吸收弱。190 nm处均无吸收，在280 nm处总体出峰数不如254 nm处的效果。

表1 反相液相色谱法分离乌骨鸡活性肽的优化过程

2.1.3 反相液相色谱法优化乌骨鸡活性肽分离条件的应用

通常对一次分离中分辨率不好的亲水性多肽混合物进行二次分离，可以得到多个新肽，同时放大到制备级HPLC中，结合质谱共同引导实现多肽的全自动化分离和收集[13]。由于C18反相色谱柱的柱效高，TSKgel凝胶色谱柱可以用来确定分离物分子量分布，实际实验中通常将优化的分析级反相色谱法和凝胶色谱法相互结合使用[17]。本实验中，C18反相液相色谱法采用甲醇/水体系进行优化分析，需要更为精细的优化时，可将其梯度洗脱体系或乙腈体系作为流动相代替其进行进一步分离纯化。

2.2 凝胶色谱柱过滤色谱法分离乌骨鸡活性肽的优化结果分析

2.2.1 凝胶过滤色谱法优化结果

TSKgel-三氟乙酸/乙腈/水体系中，研究不同波长条件下TSKgel凝胶过滤色谱法优化乌骨鸡活性肽，结果如图2所示。由图2可知：在分离小分子多肽时，凝胶过滤色谱法的实验优化结果为TSKgel柱-0.1%三氟乙酸/(10%～25%)乙腈/水体系-流速0.5 min/mL-进样量5 μL-波长220 nm。若不考察出峰数，只考察分离度和峰形进行选择时，应选择的优化结果为TSKgel柱-0.1%三氟乙酸/(15%～65%)乙腈/水体系-0.5 min/mL流速-进样量10 μL -波长254 nm，此时出峰数较少，但分离度和峰形都较好。

图2 TSKgel凝胶过滤色谱法优化乌骨鸡活性肽的分离条件Fig.2 Optimizing isolation condition of peptides by TSKgel filtration chromatography

2.2.2 凝胶过滤色谱法优化过程分析

主要考察凝胶色谱柱、乙腈、流速、进样量和波长等指标对乌骨鸡多肽分离效果的影响，优化过程如表2所示。由表2可知：乙腈梯度洗脱时，分离效果最好，随着梯度中乙腈含量降低至一定程度，出峰数增加至最大。当变换流速时，流速为0.4或0.5 mL/min时，分离效果一致好于流速为0.3 mL/min时。当进样量为5、10 μL时，波长对峰形、出峰数几乎无影响。波长为190 nm时样品均无吸收，且当波长为254和280 nm时，样品的吸收强度较小。

表2 凝胶过滤色谱法分离乌骨鸡活性肽的优化过程

2.2.3 凝胶过滤色谱法优化乌骨鸡活性肽分离条件的应用

在使用凝胶色谱柱-三氟乙酸/乙腈/水体系之前，笔者采用了价格低廉的三氟乙酸/甲醇/水体系的梯度洗脱条件分离乌骨鸡活性肽，但该体系分离乌骨鸡多肽效果不理想，可能是由于凝胶柱的柱效差或甲醇洗脱效果不好等因素导致[18]，故采用乙腈/水体系进行分离条件优化。另外，在采用凝胶色谱法分离时，并未使用磷酸盐作缓冲液，是因为三氟乙酸作缓冲液时，未见相对集中的分离峰出现。根据峰的保留时间分段收集凝胶色谱法分离样品后得到的馏分，再结合C18反相色谱法进行馏分分离，这样可实现多肽不同分子量段的深入分离、纯化及分析等[17]。当混合多肽过于复杂、目标物质相对丰度较低时，可先使用本实验已经优化的凝胶色谱法的分离条件，然后采用甲醇或乙腈梯度洗脱体系继续优化C18色谱分离条件，从而实现目标物质的纯化。

3 结论

反相液相色谱法分离小分子多肽的优化条件：C18柱-pH 6.0磷酸盐/6%甲醇/水体系-流速0.2 mL/min-进样量5 μL-波长220 nm。凝胶过滤色谱法分离小分子多肽的优化条件：TSKgel柱-0.1%三氟乙酸/(10%～25%)乙腈/水体系-流速0.5 mL/min-进样量5 μL-波长220 nm。当使用反相液相色谱法分离小分子多肽时，随甲醇含量及流速的降低，出峰数增加；三氟乙酸或磷酸盐作缓冲液时出峰数几乎一致，但分离度不同。凝胶色谱法分离小分子多肽时，乙腈梯度洗脱较无梯度洗脱分离效果好，且乙腈梯度浓度降低到一定程度后，分离效果不变。该研究为乌骨鸡多肽及多肽类天然食品的精细分离纯化提供参考。