高效液相色谱法联用蒸发光散射测定薏苡仁多糖的单糖组成

茅宇娟，王 欢，曾 陵，陈 虹

(1.张家港市中医医院 药剂科，江苏 张家港 215600；2.雷允上药业集团有限公司，江苏 苏州 215009；3.苏州富士莱医药股份有限公司,江苏 苏州 215522)

薏苡仁，俗称米仁、六谷子，又名薏仁、薏米、苡仁等，为禾本科植物薏苡Coixlacryma-jobiL. var. mayuen (Roman) Stapf的干燥成熟种仁，具有健脾、除痹、渗湿和止泻等功效，临床上主要用于治疗水肿、湿痹拘挛、小便不利、脚气以及脾虚泻泄等病症[1-2]。薏苡仁主要分布于福建、河北和辽宁等地，在我国长江以南(贵州、广西、福建和台湾)、泰国、越南和老挝等地均有种植[3-4]。现代药理学研究表明：薏苡仁的主要活性成分包括大分子如多糖类，小分子如内酰胺类、不饱和脂肪酸类及酯类等，具有降血糖、抗肿瘤、抗炎镇痛以及提高机体免疫力等药理活性[5-6]。薏苡仁中含多糖类成分质量分数可达65%～70%，其中淀粉占60%～65%，其他多糖占5%[7]。刘想[8]采用高效液相色谱法(HPLC)对纯化后的薏苡仁多糖进行了组成分析，证明薏苡仁多糖包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

目前，测定多糖中单糖组成的定量方法还有很多，例如早期常用的薄层色谱法[9]、紫外分光光度法、高效液相色谱-紫外检测法[10]等，随着技术的不断发展，现在的检测方法也越来越多，例如高效液相色谱-示差检测法[11]、高效液相体积排阻色谱法[12]、离子色谱法[13]和高效毛细管电泳法[14]等。本实验采用HPLC联合通用型蒸发光散射检测器(ELSD)对薏苡仁多糖的单糖组成进行测定，该方法与其他几种方法相比，具有以下优点：1)对于分析单糖组成复杂的多糖，该方法分离度好，灵敏度高，对于常见的单糖成分均能达到有效分离；2)供试品溶液的制备方法简单，无须进行柱前衍生化，即可直接进行测定；3)色谱条件成本较低，其中色谱柱是氨基柱，相对于其他方法的毛细管柱、糖柱更经济；4)该方法准确度高、重复性好、操作快捷，是一种值得大力推广的单糖组成分析方法。

目前对薏苡仁多糖的研究主要还是集中在药理实验上，而对其结构组成却缺乏数据，本实验采用HPLC-ELSD法对薏苡仁多糖的单糖组成进行测定，旨在为阐明薏苡仁多糖的结构组成奠定基础，以期为构效关系及药效物质基础的分析提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

三氟乙酸(HPLC)，美国Sigma-Aldrich公司；乙腈(HPLC)，美国Merck公司；其他试剂均为分析纯。D-甘露糖(批号：LG20M03)、L-阿拉伯糖(批号：LMA0L06)和岩藻糖(批号：L630014),北京百灵威科技有限公司;L-鼠李糖(批号：10158772),阿法莎(天津)化学有限公司;D-葡萄糖醛酸(批号：140648-200602),中国药品生物制品检定所;D-半乳糖醛酸(批号：A0404A),大连美仑生物技术有限公司;D-葡萄糖(批号：K7TFO-CN),东京化成工业株式会社;D-半乳糖(批号：10509),德国Augsburg公司;薏苡仁多糖(批号：20161212、20161214和20161218),自制。

1.2 仪器设备

Agilent 1260型高效液相色谱仪、ELSD检测器，美国Agilent公司；R-210型旋转蒸发仪，瑞士布奇公司；CPA224D型电子分析天平，德国赛多利斯公司；纯水仪，美国密理博公司；HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市精达仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

Supelco®APHERA NH2Polymer色谱柱(150 mm×2 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.05 mol/L醋酸铵溶液(体积比为85∶ 15)；流速为0.2 mL/min；进样量为10 μL；柱温为35 ℃；ELSD检测条件：蒸发温度为60 ℃，载气流量为1.6 L/min。

1.3.2 对照品溶液的制备

分别精密称取甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖醛酸(GlcA)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)和岩藻糖(Fuc)对照品50 mg，置同一50 mL量瓶中，加适量水使其溶解，并定容至刻度、摇匀，即得混合单糖对照品储备液。

1.3.3 薏苡仁多糖的制备

称取薏苡仁适量，捣碎，加10倍量95%(体积分数，下同)乙醇回流提取2次，每次2 h，过滤，药渣晾干至无醇味，加10倍量的水水浴提取2次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩，加入95%乙醇，使乙醇体积分数达80%，4 ℃下静置4 h，离心，沉淀减压干燥，即得薏苡仁多糖。

1.3.4 供试品溶液的制备

精密称取薏苡仁多糖干燥品10 mg，置安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸5 mL，密封，于110 ℃下水解8 h，冷却至室温，准确移取1 mL水解液，80 ℃ N2吹干，加60%(体积分数)乙腈转移至10 mL量瓶中并定容至刻度，摇匀、过滤，取续滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

在1.3.1项色谱条件下，Man、Gal、GlcA、Rha、GalA、Glc、Ara、Fuc 8种单糖分离度均大于1.5，理论塔板数以8种单糖计均不低于4 000，如图1所示。由图1可知，该色谱系统适用性良好，可以用来准确测定薏苡仁多糖中的单糖组成。

图1 对照品溶液(a)、供试品溶液(b)的 HPLC-ELSD色谱Fig.1 HPLC-ELSD chromatogram of reference solution (a) and test solution (b)

在进行系统适用性试验过程中，本实验对洗脱条件进行了优化。氨基柱分析多糖类成分所用流动相通常为乙腈和水按一定比例组成的混合溶液。实验初期使用的流动相就是不同比例的乙腈-水混合溶液，但均不能达到良好的分离度，可能由于涉及的单糖种类太多，且极性过于相近，于是往水中加入缓冲盐醋酸铵，配制成浓度为0.05 mol/L的溶液，结果8种单糖均得到良好分离，故最终确定流动相为乙腈-0.05 mol/L醋酸铵溶液，体积比85∶ 15。

本实验还对ELSD的检测条件进行了优化。通常影响测定结果的最主要参数就是蒸发温度和载气流量，其对信噪比影响很大。本实验考察蒸发温度的点分别为50、60、70和80 ℃，载气流量分别为1.2、1.6和2.0 L/min，结合信噪比结果见图2。由图2可知：蒸发温度在50 ℃时信噪比最低，60 ℃最高，70和80 ℃居中；而载气流量对信噪比的影响则是1.6 L/min最大，故最终选择蒸发温度为60 ℃，载气流量为1.6 L/min，此条件下系统灵敏度最高。

图2 蒸发温度(a)和载气流量(b)对信噪比的影响Fig.2 Effects of evaporation temperature (a) and carrier gas flow rate (b) on signal-to-noise ratio

2.2 线性关系考察

分别精密量取1.3.2项下的储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品系列溶液。按1.3.1节中的色谱条件进样测定，以对照品进样量的对数为横坐标X，单糖峰面积的对数为纵坐标Y进行线性回归，结果显示各成分线性关系良好，回归方程见表1。由表1可知：8种单糖的回归方程相关系数均大于0.999，在0.5～5μg范围内呈良好的线性关系，因此可以准确测定8种单糖的含量。

表1 8种单糖线性关系

2.3 精密度试验

取1.3.2节中的方法配制所得的对照品溶液(浓度为0.2 mg/mL)，在1.3.1节中的色谱条件下，连续进样6次，测得8种单糖峰面积，计算得GlcA、Man、Fuc、Rha、GalA、Gal、Ara和Glc峰面积相对标准偏差(RSD)分别为1.15%、1.55%、1.25%、1.44%、1.58%、0.83%、1.37%和1.77%，RSD值均低于2%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

称取6份同一批次的样品(批号：20161212)，按1.3.4节中的方法制备供试品溶液的方法进行操作，依1.3.1节中的方法色谱条件进样测定峰面积。结果表明：该多糖主要由7种单糖组成，分别为Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara，其含量RSD分别为1.26%，1.44%，1.65%，1.84%、0.77%，1.17%、0.94%，表明重复性良好。

2.5 稳定性试验

取2.4节中的方法制备的同一份供试品溶液，以1.3.1节的色谱条件，分别于0、2、4、8、12和24 h 进样测定，结果表明：Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara峰面积的RSD分别为1.34%、0.63%、1.78%、1.19%、0.85%、1.63%和1.54%，表明供试品在24 h内基本稳定。

2.6 回收率试验

称取批号为20161212的薏苡仁多糖5 mg，共6份，分别精密加入一定量的Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara对照品溶液，使加入量与供试品中含量比约为1∶ 1，分别按1.3.4节中的供试品溶液制备方法操作，并在1.3.1节中的色谱条件进行测定，测定峰面积，带入标准曲线计算回收率，结果见表2。由表2可知：该方法回收率良好，回收率均在97.4%～100.4%。

表2 回收率实验结果(n=6)

2.7 样品测定

分别取3批薏苡仁多糖，分别按1.3.4节中的供试品溶液制备方法操作，并在上述色谱条件下进行测定，结果见表3。

由表3可知：薏苡仁多糖主要由Glc组成，另外还含有少量的Gal、Fuc、Rha、GlcA、Man和Ara。本研究制备所得薏苡仁多糖组成与刘想[8]报道的结果略有不同，本研究结果比其多了GlcA和Fuc，少了木糖(Xyl)，推测原因可能是由于制备纯化工艺不同，导致结构组成略有差异。

表3 薏苡仁多糖中单糖组成测定结果(n=3)

3 结论

建立了一种适用于测定薏苡仁多糖中单糖组成的HPLC-ELSD方法，通过色谱条件优化，最终确立最佳色谱条件：色谱柱为Supelco®APHERA NH2Polymer色谱柱 (150 mm×2 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.05 mol/L醋酸铵溶液(体积比85∶ 15)；流速为0.2 mL/min；进样量为10 μL； 柱温为35 ℃；ELSD检测条件为漂移管温度为60 ℃，载气流量为1.6 L/min。研究结果表明：Man、Gal、GlcA、Rha、GalA、Glc、Ara和Fuc的进样量对数值与峰面积对数值在一定范围内均呈现出较好的线性关系(0.991～0.999 9)，回收率均在97.4%～100.4%，RSD均小于2%。证明该测定方法准确可靠，分离效果好，可用于测定薏苡仁多糖的单糖组成。