同时检测降脂红曲中酸式和内酯式洛伐他汀的TLC方法的建立

郑文伟 林军 吴丽云 林风

(福建省微生物研究所，福建省红曲微生物技术开发应用工程研究中心，福州 350007)

薄层色谱法(TLC)法作为一种快速、简单、专属性强的鉴别方法，已被广泛用于中药材及中成药的鉴别[1-2]。天然发酵的降脂红曲中通常同时含有酸式和内酯式两种结构洛伐他汀成分，前者降脂活性约为后者的2倍[3]。由于酸式结构不稳定且易转化为稳定的内酯式结构，所以2015版中国药典中成药血脂康原料标准只把内酯式洛伐他汀的含量作为质量评价标准[4]，导致功能红曲中的酸式结构成分被广泛忽视。功能红曲中洛伐他汀检测几乎都采用HPLC方法。HPLC方法虽能同时检测出酸式和内酯式结构成分，但因其成本高、耗时长、效率低，无法满足于大量样品检测分析的需要。目前应用于降脂红曲的TLC方法研究甚少[5-6]。因此，建立一种能同时检测降脂红曲中酸式和内酯式洛伐他汀成分的TLC方法，对今后降脂红曲的质量控制有着重要意义。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

降脂红曲(6批均由福建省微生物研究所收藏的不同优良红曲霉菌接种于大米发酵而成)；洛伐他汀对照品(批号：100600-201805，中国食品药品检定研究院)；乙腈(HPLC级别，德国Merck公司)；硅胶G薄层板(批号：20190102，青岛海洋化工)；二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸、丙酮、酒精、磷酸、磷钼酸、甲醇、氨水、碘均为分析纯。

1.2 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪、DAD二极管阵列检测器(美国Agilent公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；超声清洗仪(昆明市超声仪器有限公司)；高速离心机(美国Sigma公司)；电子分析天平(上海力辰有限公司)；粉碎机(九阳公司)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 内酯式洛伐他汀溶液配制

精密称取洛伐他汀对照品适量，置于10mL容量瓶中，加入体积分数75%乙醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为1.150mg/mL标准母液，4℃下保存备用。

2.1.2 酸式洛伐他汀溶液制备[7]

精密量取“2.1.1”项的对照品溶液适量，加入0.2mol/L NaOH溶液，50℃下超声处理1h，冷却至室温后加入盐酸调节中性，混匀，0.45μm滤膜过滤，滤液4℃下保存备用。

2.1.3 提取剂的选择及供试品溶液制备

本课题组前期考察了不同浓度(50%、75%和100%)的甲醇、乙醇和乙腈为提取剂时红曲中洛伐他汀的提取效率。实验结果发现50%乙腈、75%乙醇的提取率均较高，且两者提取效果接近，故本实验最终选择以更为环保的75%乙醇作为提取剂。

取降脂红曲粉末1g，置于具塞锥形瓶中，加入75%乙醇4mL，混匀，超声处理1h，离心，取上清液作为供试品溶液。

2.1.4 展开剂选择

吸取适量的内酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、6批降脂红曲供试品溶液，点于同一块硅胶G薄层板(平行试验3次)，分别以氯仿-甲醇-氨水(25:75:1)[5]、二氯甲烷-丙酮(4:1)[4]为展开剂，展开，取出并晾干，用碘蒸气熏至斑点清晰。结果以氯仿-甲醇-氨水(25:75:1)为展开剂时，内酯式洛伐他汀斑点清晰且展距合适，但酸式洛伐他汀的展距却很小(图1A)；以二氯甲烷-丙酮(4:1)为展开剂时未见酸式洛伐他汀斑点(图1B)。

针对上述薄层色谱结果，本研究对展开剂进行改进，换成二氯甲烷-丙酮-甲酸(75:25:1)、二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)。结果以二氯甲烷-丙酮-甲酸(75:25:1)为展开剂时酸式、内酯式洛伐他汀均能显示斑点，但酸式洛伐他汀有其他成分干扰(图1C)；以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)为展开剂时，酸式、内酯式洛伐他汀斑点清晰且分离良好，Rf值适中(图1D)。故最终选择二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)为展开剂。

2.1.5 上样量选择

分别吸取1、2、3、4、5、6、7、8、9和10μL供试品溶液点于同一块硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)为展开剂，展开，取出并晾干，并分别置于碘蒸气下熏至斑点清晰。结果发现上样量8μL时，斑点清晰，拖尾现象较小，故以8μL为上样体积。

2.1.6 显色方法选择

图1 不同展开剂下的薄层色谱图Fig.1 TLC of different developing solvents

吸取内酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、6批降脂红曲供试品溶液各8μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)为展开剂，展开，取出并晾干后并分别置于碘蒸气、5%磷钼酸、10%硫酸乙醇溶液、紫外灯(254nm波长下)4种显色方法下显色。结果如图2所示，4种显色方法下，均能观察到6批功能红曲样品在与内酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀相对应位置上出现相同颜色斑点(碘蒸气作用下斑点呈黄色，详见图2A；5%磷钼酸乙醇溶液作用下斑点呈蓝绿色，详见图2B；10%硫酸乙醇溶液作用下斑点呈蓝紫色，详见图2C；254nm紫外灯下斑点呈蓝色荧光，但颜色较淡，详见图2D)。以上4种显色方法斑点清晰程度顺序为：碘蒸气＞5%磷钼酸乙醇溶液＞10%硫酸乙醇溶液＞紫外灯(254nm)，故将碘蒸气优先作为显色剂。

图2 不同显色条件下的薄层色谱图Fig.2 TLC of different chromogenic agents

2.1.7 检出限考察

将“2.1.1”和“2.1.2”项下的对照品溶液稀释成不同浓度，分别吸取8μL(相当于0.115、0.230、0.575、1.150、2.300、3.450、4.600和5.750μg的内酯式洛伐他汀；相当于0.092、0.184、0.460、0.920、1.840、2.760、3.680和4.600μg酸式洛伐他汀)点于同一块硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)为展开剂，展开，取出并晾干后置于碘蒸气显色。本实验以薄层板上能显色斑点的最小浓度作为该方法的检出限。2015年版中国药典血脂康胶囊/片的原料红曲标准、2015年版《四川省中药炮制规范》、2007年版《云南省中药材标准》分别规定降脂红曲所含内酯式洛伐他汀含量分别不得低于2.2、4和4mg/g[4,8-9]。如图3所示，内酯式洛伐他汀在B位置处斑点开始显色，检出限为0.230μg(相当于含0.12mg/g内酯式洛伐他汀的降脂红曲)；酸式洛伐他汀在K位置处斑点开始显色，检出限为0.460μg(相当于含0.23mg/g酸式洛伐他汀的降脂红曲)，说明所建立的TLC法灵敏度较高，能满足市面大部分降脂红曲的鉴别。

图3 薄层色谱检出限Fig.3 The detection limit of TLC

2.2 HPLC测定降脂红曲中洛伐他汀含量

2.2.1 色谱条件[10-11]

反相色谱柱为Kromasil C18(250mm×4.6mm, 5μm)；柱温为28℃；流动相为乙腈-0.1%磷酸水(65:35)；检测波长为238nm；上样量为10μL。

2.2.2 样品处理[10]

将红曲粉末粉碎(过40目筛)，粉末充分混合均匀，准确称取约500.0mg样品于50mL容量瓶中，加入30mL体积分数为75%乙醇，摇匀，室温下超声50min。加入75乙醇至刻度，超声10min,冷却至室温后75%乙醇定容至刻度，离心，取上清液备用。

2.2.3 样品中洛伐他汀含量检测

将6批红曲按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下的色谱条件进样分析，求算出样品中洛伐他汀平均含量。结果表明，6批降脂红曲中均检测到酸式和内酯式洛伐他汀，且酸式结构所占比例在40.15%～49.40%(表1)，与TLC检测结果相似。

3 讨论

降脂红曲的质量控制直接关系到降脂红曲及其相关制剂的临床用药安全性、有效性。洛伐他汀不仅是降脂红曲主要降血脂功效成分[12]，也是区别降脂红曲与普通红曲的重要依据。酸式洛伐他汀能直接竞争性地抑制胆固醇合成途径中的限速酶—HMGCoA还原酶，从而有效减少或阻断胆固醇合成[13]。而内酯式洛伐他汀(市售洛伐他汀化药也为内酯式)须经过肝脏分泌的羟基酯酶水解成酸式结构才能发挥功效，长期服用具有一定肝损伤和肌肉损害[14]，且功效约酸式的一半[3]。因此，酸式洛伐他汀是衡量降脂红曲安全性、有效性的核心指标[15]。2015版中国药典中成药血脂康项下的红曲原料标准中虽有TLC方法，但只能对红曲中内酯式洛伐他汀检测[4]。而像福建省中药材标准、湖南省中药材标准、湖北省中药材标准等省市地方标准大多尚无红曲鉴别、检测的TLC方法，依旧是以水分、灰分控制及显微鉴别来衡量红曲质量[16-18]，这难以真正地控制红曲质量。而本研究所建立的TLC方法具有简单、快速等特点，可用于降脂红曲的质量控制中。

表1 降脂红曲中洛伐他汀含量测定(n=3)Tab.1 The content of lovastatin in lipid-lowering Hongqu(n=3)