抗生素链霉菌合成喷司他汀发酵工艺的关键原料研究

郑孝贤

(福建省微生物研究所，福州 350007)

喷司他汀(pentostatin)是一种由抗生素链霉菌产生的高效、不可逆的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)抑制剂，具有广泛的免疫调节活性[1-2]。1974年Peter和Henry等[3-4]首次报道从抗生素链霉菌(Streptomycesantiboticus)的发酵液中分离到喷司他汀。1991年11月美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准注射用喷司他汀注射剂上市[5]，商品名为Nipent，主要用于干细胞白血病(hairy cell leukemia, HCL)以及慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)和蕈样霉菌病(Mycosis fungoides)的治疗。

目前喷司他汀的合成方法主要有化学合成和微生物发酵两种方法，其中喷司他汀化学合成路线长，收率低，成本较高[6]；而微生物发酵研究报道较少，发酵产量低，目前报道的喷司他汀产量最高为100mg/L[7-10]。本研究通过考察抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀的关键原料，提供一种新的发酵培养基配方以及相应的5000L发酵罐生产工艺，显著提高喷司他汀的发酵单位，适用于喷司他汀的规模化生产。

1 仪器与材料

液相色谱仪(日本岛津公司Shimdzu 10 AVP型)；喷司他汀对照品(美国Hospir公司提供，99.59%)；振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)、离心机(贝克曼库尔特公司Allegra X 15-R)、5000L发酵罐(福建微生物研究所自建发酵罐)；大豆油(山东鲁花集团有限公司)；花生油(山东鲁花集团有限公司)；菜籽油(山东鲁花集团有限公司)；橄榄油(益海嘉里食品营销有限公司)；芝麻油(山东鲁花集团有限公司)；玉米淀粉(长春大成实业集团有限公司)；葡萄糖(上海展云化工有限公司)；黄豆粉(自加工产品)；酪蛋白(北京双旋微生物培养基制品厂)；酵母粉(广东江门生物技术开发中心有限公司)；碳酸钙(永安智胜化工有限公司)。

2 菌株

Streptomyces antibioticusFim0426，由福建省微生物研究所保藏。

3 方法

3.1 摇瓶培养基及培养方法

斜面培养基：葡萄糖1.0%，酪蛋白0.3%，酵母粉0.3%，琼脂1.5%，pH自然，28℃培养7～10d。

种子培养基：葡萄糖1.0%，酪蛋白0.3%，玉米淀粉1.0%，酵母粉0.3%，pH自然，装量80/500mL，28℃培养48h。

发酵培养基：葡萄糖3.0%，黄豆粉3.5%，玉米淀粉1.0%，酵母粉0.25%，碳酸钙0.35%，蛋白胨0.3%，豆油1.5%，pH自然，装量80/500mL，28℃培养168h。

3.2 发酵罐工艺

摇瓶种子按“3.1”项方法培养，以0.5%接种量接入一级种子罐，装量120L/200L。28℃培养72h后以5%接种量接入二级种子罐，装量250L/500L。28℃培养30h后以5%接种量转入5000L发酵罐，装量3000L/5000L，28℃发酵140h时发酵终止。

5000L发酵罐培养条件：发酵温度28℃，罐压0.04MPa，通气1：0.8vvm，转速200r/min。

3.3 喷司他汀效价测定

试样制备：发酵液以5000r/min离心10min，取上清液检测。

HPLC检测：色谱柱：Phenomenon Luna C8(250mm×4.6mm, 5μm)；流动相：2.5g/L乙酸铵溶液-甲醇-乙腈(960:20:20)；柱温：20℃；流速：1.0mL/min；检测波长282nm。

3.4 生物量测定

取发酵液10mL以5000r/min离心10min，取菌丝体用蒸馏水洗涤，再次离心，于55℃干燥至恒重。依下列计算生物量：生物量=菌体重量×100(g/L)[11]。

3.5 葡萄糖和总糖测定

发酵液离心取上清液，采用斐林试剂法测定葡萄糖和总糖[12]。

3.6 氨基氮测定

发酵液离心取上清液，采用甲醛法测定氨基氮[13]文中摇瓶发酵单位和生物量的数据重复实验3次，取平均值。

4 结果与讨论

4.1 抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀发酵培养基关键原料考察

以“3.1”项下配方为基础，对抗生素链霉菌摇瓶发酵生产喷司他汀的培养基浓度进行优化调整，同时考察对发酵工艺有显著影响的关键原料。分析7种原料分别对发酵单位的影响，采用SPSS软件的单因素方差分析各个水平组间均数差别有无统计学意义。选定喷司他汀发酵培养基各组分的5个浓度水平，每个水平重复试验3次。结果如图1所示，经过对培养基中各种成分详细分析及评估，确定培养基成分葡萄糖3%，黄豆粉3%，玉米淀粉1.5%，豆油1.5%，酵母粉0.25%，碳酸钙0.35%，蛋白胨0.3%。将其中豆油定为关键原料。评估依据如表1所示。豆油的概率P值为0.017，小于显著性水平0.05，对发酵单位影响达到显著水平。不同豆油浓度下喷司他汀产量最低142mg/L，最高达181mg/L。表明植物油对喷司他汀合成影响显著，发酵培养基中植物油可能影响发酵过程中的溶氧、pH和其他发酵环境。葡萄糖和黄豆粉的概率P值都小于0.05，对发酵单位也有显著影响。但这两个因素的发酵单位都不高，最高效价均低于150mg/L，对提高喷司他汀的发酵单位未有积极影响，关键性评估为中级。玉米淀粉、酵母粉、碳酸钙和蛋白胨的概率P值均大于0.05，对发酵单位影响未达到显著水平，关键性评估为低级。

4.2 植物油对抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀的影响

图1 发酵培养基主要成分对喷司他汀合成的影响Fig.1 Pentostatin yield comparison among main materials for fermentation medium

表1 关键原料的分析及评估Tab.1 Analysis and evaluation of critical materials

植物油作为培养基的重要成分，对抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀发挥重要作用。本文在喷司他汀发酵培养基中添加不同浓度大豆油、花生油、棉籽油、菜籽油、橄榄油和芝麻油，培养7d后测其喷司他汀含量和生物量，结果如图2所示。从图2可以看出，菌体量的增长与喷司他汀发酵单位的增长有一定的相关性，总体趋势是一致的。随着培养基中植物油浓度增大，菌丝量和发酵单位随之增高。但到一定浓度时，由于培养基植物油浓度偏高，菌体生长受到抑制，发酵单位也随着降低。其中棉籽油和大豆油对抗生素链霉菌合成喷司他汀有显著促进作用。添加0.5%的棉籽油发酵单位最高达210mg/L；添加1.5%大豆油发酵单位为181mg/L。花生油、菜籽油、橄榄油和芝麻油这4种植物油对提高喷司他汀的产量影响有限。适量的棉籽油和大豆油有利于菌体大量合成，也提高了喷司他汀的发酵单位。但大豆油发酵后发酵液呈褐色油状，菌丝体较为分散，给后续的分离纯化带来困难。而利用棉籽油作为培养基的发酵液清亮，质地轻薄，容易过滤和分离。故采用棉籽油进行下一步研究。

4.3 不同供应商的棉籽油对抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀的影响

棉籽油为植物提取物，其含量因产地、采收季节的不同而呈现出大的波动。当棉籽油所含成分变动较大时，有可能引起发酵过程中喷司他汀产量较大波动。另外棉籽油含有某些对人体有害物质如棉酚，如不加以控制，这些有害物质可能带入原料药并可能因此引起疗效和安全性方面的问题。因此，在进行喷司他汀发酵生产前，有必要对发酵中的关键原料棉籽油有充分的认识，并据此选用适宜的原料供应商。

本文对市场上不同来源的棉籽油进行初步考察。根据不同产地多个厂家产品的分析结果，评估不同供应商的棉籽油对抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀的影响。按照“4.1”项和“4.2”项的研究结果确定的培养基配方，采用4种不同供应商的棉籽油对抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀进行比较研究。结果如图3所示，不同来源的棉籽油对喷司他汀的合成有显著影响。使用上海B公司的棉籽油作为发酵培养基，浓度为0.5%时喷司他汀发酵单位达232mL/L，结果较原始工艺181mg/L提高了28%。发酵液黝黑透亮，油花极少，有利于后续分离纯化，提高收率。使用北京A公司的棉籽油最高发酵单位为210mL/L。使用湖南C公司和广西D公司的棉籽油最高单位分别为206和190mL/L，其中广西D公司需提高棉籽油浓度达0.75%才能获得较高单位，植物油未被菌丝完全吸收，给后续分离纯化带来困难，影响产品收率。故采用0.5%浓度上海B公司的棉籽油进行下一步研究。

图2 植物油对喷司他汀合成和生物量的影响Fig.2 Pentostatin productivity and cell growth comparison among fermentations run with different plant oil

图3 不同厂家棉籽油对喷司他汀合成的影响Fig.3 Yield comparison of fermentation carried out with cottonseed oil from different suppliers

4.4 5000L发酵罐工艺验证

在5000L发酵罐上验证“4.3”项下所筛选的棉籽油对喷司他汀合成的影响。按“3.3发酵罐工艺”方法，每隔24h取罐内样品测定发酵效价、菌丝浓度、总糖、还原糖和氨基氮等指标，进一步了解发酵罐生产的发酵代谢特征，变化趋势见图4。由图4可知，菌丝量和喷司他汀发酵单位一直平稳增长，到发酵后期约144h，菌体开始自溶生物量下降，发酵单位也随之下降。菌丝量与喷司他汀产量发酵曲线具有相同趋势的特征。由发酵过程中糖氮代谢曲线可以看出，总糖和还原糖代谢曲线较为同步，发酵前期两者迅速下降，到72h总糖降至0.72%、还原糖降至0.48%时，开始缓慢而平稳的下降，120h后总糖保持在0.4%左右，还原糖几乎降为0。氨基氮一直稳步下降，至144h降至最低，此时发酵单位最高，168h氨基氮回升，可能是由于菌体自溶释放出游离氨基氮。

图4 5000L罐中喷司他汀、生物量和糖氮代谢曲线Fig.4 Pentostatin yield, cell growth profiles, total sugar, reducing sugar and amino nitrogen consumption comparison plots at 5000L fermentor

表2为5批5000L发酵罐的测定结果。结果显示，5批发酵液平均发酵单位为203mg/L；平均每批发酵罐产喷司他汀5.73kg。采用新工艺的5000L发酵罐发酵单位最高达210mg/L，较原始工艺121mg/L提高了74%。新工艺增加了喷司他汀的产量，降低了植物油的用量，发酵过程稳定，容易控制，摇瓶工艺更容易在发酵罐生产重现，摇瓶的发酵单位与发酵罐培养发酵单位接近。发酵液中油残留量较低，改善发酵液质地黏稠的性状，使发酵液易于过滤、提取和纯化，产品收率也大大提高。

4.5 讨论

植物油对抗生素链霉菌合成喷司他汀作用较为显著，分析其原因可能有3个。第一是植物油可能为喷司他汀的合成提供前提物质。抗生素链霉菌可将植物油分解生成脂肪酸，脂肪酸在微生物作用下可经乙醛酸循环和糖异生作用生成糖，包括合成喷司他汀所需的戊糖结构[6,14-16]，具体的影响机制需进一步实验证明。第二是植物油可能影响喷司他汀发酵环境。喷司他汀发酵培养基中含有大量的有机氮源成分，如0.25%酵母粉，0.3%蛋白胨和3%黄豆粉，这样的配方在发酵过程中很容易起泡，影响链霉菌的呼吸，从而影响喷司他汀的产量。适量的植物油可以控制泡沫的产生，保障发酵生产喷司他汀正常进行。第三是过量的植物油影响提取收率。过量的植物油使发酵后期培养基会出现油花或油层，影响菌体的生长和对底物的吸收，并给后续提取工艺带来困难，降低产品收率。因此植物油对喷司他汀发酵的影响是多方面的，控制植物油的来源和用量对生物合成喷司他汀显得尤为重要。

表2 5批5000L发酵罐发酵结果测定Tab.2 5 batches pentostatin yield at 5000L fermentor

本文通过对发酵培养基中主要成分的研究，提出控制关键原料增加喷司他汀产量的方法。通过考察和评估抗生素链霉菌发酵生产喷司他汀培养基的关键原料，确定发酵工艺中的关键原料棉籽油的供应商，对棉籽油来源、质量和用量进行有效控制，提高了喷司他汀的摇瓶和发酵罐发酵单位，改善喷司他汀发酵液质地，有利于后期分离纯化工作。原始工艺采用1.5%豆油作为培养基，摇瓶单位120mg/L，发酵罐单位181mg/L；大量的豆油可能不利于菌体对氧化底物的吸收，影响喷司他汀的合成，同时发酵液中残留的豆油给提取纯化工艺带来困难。新工艺采用0.5%上海B公司提供的棉籽油作为培养基，摇瓶单位232mg/L，发酵罐单位210mg/L；不仅提高了摇瓶发酵单位，对发酵罐生产喷司他汀的产量增长影响尤其显著。发酵罐生产条件下优质棉籽油更有利于菌体对植物油的利用，提高发酵单位，使发酵罐的单位体积产量接近摇瓶发酵水平。

本文提供一个高产喷司他汀的发酵方法，通过控制关键物料，大幅提高喷司他汀的产量，为实现喷司他汀的大规模工业化生产提供一种新思路，研究结果也可供其他利用植物油发酵的品种工业化研究参考。

致谢：感谢邱光荣、林永勉、徐兰和林斌等同志在研究中给予的帮助和支持。