铜绿假单胞菌III型分泌系统相关毒力基因在抗菌药物中表达差异的研究

方雪瑶 胡龙华 杭亚平 胡晓彦 俞凤 陈艳慧 钟桥石

(南昌大学第二附属医院检验科，江西省检验医学重点实验室，南昌 330006)

铜绿假单胞菌是临床常见条件致病菌之一，常引起免疫低下患者的各种急慢性感染。研究表明，III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)在铜绿假单胞菌的感染及致病过程中发挥重要作用[1]，其中效应蛋白ExoS和ExoU为主的毒力蛋白表达可导致肺泡上皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的凋亡，加重炎症程度，最终导致感染难以控制[2-3]。本文将重点探讨T3SS毒力基因exoS和exoU在铜绿假单胞菌中表达差异与细菌耐药性之间的关系，以期为临床选择合适的抗感染治疗方案及预后评估提供依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2017年1月—2017年12月南昌大学第二附属医院住院患者送检的72株临床标本，其中痰液标本40株，血液标本10株，脓液标本6株，尿液标本4株，伤口分泌物标本4株，穿刺液标本3株，引流液标本3株，胆汁标本2株，均严格按照《全国临床检验操作规程》(第4版)的标准验收标本，剔除重复及不合格标本。阳性质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853，购自温州康泰生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定与药敏试验

采用Vitek2 Compact全自动微生物鉴定仪(Mérieux公司)进行菌株鉴定；药敏试验根据美国临床实验室标准委员会(The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2017版标准进行判读药敏结果。

1.2.2 提取菌株DNA

煮沸法；接种单菌落于LB平板，37℃培养24h，1.5mL EP管内加300μL无菌双蒸水，用接种环取纯分离的细菌半环到一环，加入EP管，混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心10min，分离上清即为细菌总DNA，置于-20℃冰箱备用 。

1.2.3 PCR法检测

T3SS特征片段popB基因及毒力基因exoS、exoU。引物设计参照文献[4-5]，引物由上海生工生物工程公司合成，DNA聚合酶、DNA marker均于北京天根生化公司订购(引物序列见表1)。PCR 条件设置：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s和72℃ 30s共35个循环；72℃延伸5min。PCR产物取2μL经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳后用凝胶成像仪观察结果，PCR产物送杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序后在Blast中比对。

1.3 统计学处理

以 SPSS 24.0统计软件进行数据处理，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T3SS毒力基因检测

检测72株临床分离的铜绿假单胞菌株毒力基因，发现T3SS标志性片段popB的阳性株为68株，阳性率为94.44%(68/72)；携带铜绿假单胞菌分为exoS+/exoU-、exoS-/exoU+、exoS+/exoU+和exoS-/exoU- 4种类型组合，检出率分别为56.94%(41/72)、26.39%(19/72)、4.17%(3/72)和12.50%(9/72)。其中3株细菌(4.17%)同时携带exoS和exoU毒力基因，9株细菌(12.50%)exoS和exoU均未检出exoS、exoU毒力基因(包含4株T3SS阴性的铜绿假单胞菌)。

2.2 exoS和exoU基因的分布特征

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR Primer sequences

分离的72株铜绿假单胞菌标本来源以痰液(占55.56%)、血液(占13.89%)及脓液(占8.33%)标本为主(剔除重复菌株)。各种类型标本中均以exoS+/exoU-基因组合检出率最高，在痰液、血液和脓液中检出率分别为57.50%(23/40)、70.00%(7/10)和66.67%(4/6)，详见表2。

表2 铜绿假单胞菌popB基因及毒力基因exoS和exoU的分布特征Tab.2 Distribution characteristics of popB, exoS and exoU in Pseudomonas aeruginosa

2.3 exoS和exoU基因与耐药性

携带exoU基因铜绿假单胞菌显示出对亚胺培南、氨曲南、氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物较高耐药率，其中对亚胺培南、氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率具有统计学意义(P＜0.05)；携带exoU基因的总菌株为22株，其对亚胺培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星及环丙沙星的耐药率分别为45.45%、45.45%、50.00%、50.00%、40.91%和40.91%；携带exoS基因的总菌株为44株，其对以上药物的耐药率分别为4.55%、6.82%、4.55%、18.18%、11.36%和18.18%；携带exoS基因铜绿假单胞菌对氨曲南较高的耐药性，差异无统计学意义(P＞0.05)，详见表3。

3 讨论

T3SS是铜绿假单胞菌为适应外界环境、保护自身生存进化而形成[6]，其能通过分泌exoS、exoU、exoT和exoY等效应蛋白发挥毒性作用；其中exoU是一种具有磷脂酶和腺苷酸环化酶活性的细胞毒素，可以导致不可逆的细胞膜损伤以及快速的坏死，是T3SS危害最大、最具破坏性的效应蛋白[7-8]；exoS则具有腺苷二磷酸核糖转移酶活性，可抑制宿主细胞吞噬作用、导致细胞凋亡等作用，其毒力效应仅次于exoU[9]。因此以效应蛋白exoS和exoU为主的毒力蛋白表达，可直接影响感染患者的病情进展及预后。本研究通过检测T3SS毒力基因exoS和exoU的表达情况，分析毒力基因与常用抗菌药物耐药性的关系，以期为感染此类细菌患者的治疗及预后评估提供可靠依据。

表3 携带毒力基因exoS、exoU铜绿假单胞菌与抗菌药物耐药性Tab.3 Correlation between virulence genes exoS, exoU and antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa

研究表明，几乎所有从临床或环境中分离的铜绿假单胞菌株都能检测到T3SS，但不同来源的标本常存在不同基因型组合[5]。本研究分离的72株铜绿假单胞菌中，T3SS分泌系统的携带率高达94.44%，其中exoS+/exoU-、exoS-/exoU+、exoS+/exoU+和exoS-/exoU-这4种基因型检出率分别为56.94%、26.39%、4.17%和12.50%。由于患者地域、患病类型、标本来源等的不同，与国内报道的exoS、exoU基因型检出率存在较大差异[10]。本研究所收集的各类型标本中均以exoS+/exoU-组合型检出率最高，显示铜绿假单胞菌表达毒力基因无明显感染部位差异。国外研究显示，exoU毒力基因所发挥的致死性细胞毒性可引起组织吞噬细胞损伤，这不仅使铜绿假单胞菌在病灶中持续存在，而且还会促进其他条件致病菌的双重感染，导致患者感染加重和预后不良[11]。

细菌毒力基因常与其耐药性的产生具有一定相关性，本研究发现携带exoU基因铜绿假单胞菌对亚胺培南和氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率(均＞40%)显著高于exoS基因(均＜20%)，与Wong-Beringer等[12]的研究结果一致，但目前对其耐药机制尚不完全清楚；还发现，携带exoU基因铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药率显著高于exoS基因，具有统计学意义(P＜0.05)。值得注意的是，目前国内外尚无相关报道携带exoU基因铜绿假单胞菌与氨基糖苷类耐药性具有正相关性，这可能是由于各地区抗菌药物的使用习惯不同致使临床致病菌所面临的抗菌药物选择压力不同，导致致病菌耐药基因发生相应适应性的变异，具体耐药机制需要进一步探讨研究。此外，药敏结果显示携带exoS和exoU毒力基因铜绿假单胞菌对头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦的耐药率均较低(＜20%)，表明此类药物可以作为本地区铜绿假单胞菌感染经验治疗优先考虑药物。

铜绿假单胞菌对多种抗生素天然耐药，易形成生物膜，并且常多种耐药机制共存，导致临床治疗无药可选。其中氨基糖苷类和喹诺酮类药物常用于治疗碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌，然而我们发现携带exoU基因铜绿假单胞菌对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性更高，使得临床治疗面临更大的挑战。因此进一步对铜绿假单胞菌T3SS致病性的研究及有关新颖抑制剂的开发具有重要意义，国内外现阶段在其抑制剂的研发上已取得较大进展，但对其真正作用靶点的确定仍为难题。本研究揭示铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统exoS和exoU毒力基因在抗菌药物中表达差异性，将为临床治疗感染此类细菌患者提供可靠依据。