致多部位感染肺炎克雷伯菌的毒力分析*

曹敬荣，王欣蕊,2，陈典典，王 岩，段园园，李文军，谢 威，闵 嵘，王培昌△

(1.首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053；2.首都医科大学临床检验诊断学系，北京 100053)

肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，存在于人体上呼吸道和肠道，是引起医院内各类感染最常见病原菌之一，近年来感染率显著升高[1-3]。尤其高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)侵袭力强、转移率高、致残率和致死率高[2-6]，实验室诊断方面对其生物学特性还有待明确的地方。目前hvKP主要特点是对健康宿主造成严重感染的能力，导致不同寻常的感染部位，如眼内炎和脑膜炎及神经炎；感染易转移扩散的能力，在琼脂平板上生长的菌落外观为高黏液表型[2-3,7-9]。因此，为了解宣武医院致多部位感染肺炎克雷伯菌的毒力分布及同源性，本研究回顾性分析了宣武医院2017年1月至2018年12月临床分离的肺炎克雷伯菌的临床资料、荚膜血清型、毒力基因及同源性，为减少医院感染的流行提供实验室依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 选择首都医科大学宣武医院2017年1月至2018年12月临床表现有败血症症状，血培养分离出肺炎克雷伯菌，同时其他1个或多个部位有感染表现、细菌培养为肺炎克雷伯菌，且不伴厌氧菌或其他细菌感染的患者及分离菌株作为研究对象，其中同一患者相同感染部位只选择分离出的第一株菌。

1.2仪器与试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)由德国布鲁克公司MALDI Biotyper 3.0提供；ABI Veriti 96孔梯度基因扩增仪由美国ABI公司提供；DDY-6C型电泳仪由北京六一厂提供；高速离心机(eppendorf 5415D)、恒温孵育箱由美国Thermo公司提供。哥伦比亚血平板、中国蓝平板由Oxid公司提供；EXTaq酶、DL2000 DNA 分子量和6×加样缓冲液，由日本Takara公司提供。甲酸、乙腈、α-氰-4羟基苯丙烯酸(HCCA)和三氟乙酸(TFA)由德国布鲁克公司提供。

1.3方法

1.3.1菌种复苏、传代、鉴定 在菌种库找到相应菌株，转种到血平板为“第一代”，挑取单个菌落传到血平板 35 ℃ 16～18 h至第二代(纯菌落)进行质谱鉴定和核酸提取。入选所有肺炎克雷伯菌严格按照第四版《全国临床检验操作规程》,接种血平板复苏后，使用MALDI Biotyper3.0质谱仪进行鉴定。

1.3.2黏液丝试验 使用接种环挑取血平板上的纯菌落，如不能挑起黏液丝或黏液丝长度小于5 mm判为ST阴性，如挑起的黏液丝大于或等于5 mm判为阳性[2-3]。

1.3.3毒力血清分型、基因检测 引物合成由上海生工公司合成，引物序列见表1。DNA模板提取：500 mL无菌水的EP管中取一菌环菌落混匀，100 ℃15 min，8 000 r/min，离心5 min，上清即为DNA。PCR扩增荚膜血清型和毒力基因：反应体系为25.0 μL，EX-Taq酶12.5 μL、蒸馏水5.0 μL、正向和反向引物各2.5 μL、待测样本5.0 μL。反应条件为95 ℃、预热3 min，94 ℃变性40 s、43～60 ℃退火30～60 s、70 ℃延伸 60 s，共30循环后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳120 V 30 min，经凝胶成像系统观察结果[2-3,9]。

表1 PCR扩增毒力基因引物序列

1.3.4质谱分析同源性 取分纯的肺炎克雷伯菌菌株分别点样在质谱样品靶板上，室温干燥(5～10 min)后加70%甲酸1 μL，同时加1 μL的细菌测试标准品作为质量控制，室温条件下自然晾干后加1 μL HCCA基质溶液均匀覆盖，自然晾干备用。采用质谱进行样品的数据采集和鉴定，质谱仪线性正性模式频率60 Hz，采集相对分子质量为2 000～20 000的蛋白质图谱。每个样品的蛋白谱在不同位置经过240次的激光点击获得，采集的蛋白峰信息经软件校正与仪器内数据库图谱比对，得到鉴定结果。通过flexAnalysis分析软件获取蛋白峰信息，用MALDI Biotyper3.0软件进行聚类分析及主成分分析[10-11]。

1.4统计学处理 临床分布等资料采用Whonet5.6软件分析。

2 结 果

2.1肺炎克雷伯菌的临床分布 通过Whonet5.6筛选出2017年1月至2018年12月同一患者同时侵入过血流及其他部位的肺炎克雷伯菌106株作为研究菌株，来自34位患者，均经质谱和PCR确定。肺炎克雷伯菌主要分离自重症监护室72%(77/106)、神经内科6%(6/106)、老年综合科4%(4/106)、呼吸科4%(4/106)、产科4%(4/106)、骨科4%(4/106)和血液科4%(4/106)；标本主要来源于血液34%(36/106)、痰液28%(30/106)、尿液16%(18/106)等；患者年龄分布28～91岁，平均年龄(66±5)岁，其中男性占70.7%，女性占29.3%。

2.2肺炎克雷伯菌的临床特征 34位患者中临床表现主要为血流感染(60%)、肺部感染(70%)、泌尿系感染(40%)、感染性休克(25%)及腹腔感染(8%)、胆道感染(5%)、盆腔感染(5%)和颅内感染(5%)。34例患者住院期间的临床处置包括进行手术等侵入性操作者(85%)、保留引流管者(65%)、气管切开或气管插管者(58%)、留置导尿管(25%)、胃管(8%)。患者病情好转占43%，院内病死率占40%。

2.3黏液丝试验结果 黏液丝试验阳性24例(22%)，标本主要来源于血液(30%)、痰液(30%)、尿液(17%)和引流液(8%)；黏液丝试验阴性者82例(78%)。

2.4血清型与毒力基因结果 共筛查了5个毒力荚膜血清型,包括K1 15%(17/106)、K2 42%(46/106)、K5 4%(4/106)、K54 11%(12/106)、K57 9%(9/106)，共检出高毒力血清型88株，未分型18株。PCR扩增共检测到4种毒力基因，包括rmpA基因83%(88/106)、aero基因79%(84/106)、fimH基因80%(85/106)、mrkA基因94%(100/106)，WabG基因98%(104/106)，同时携带多种毒力因子者占47%。PCR扩增结果见图1，荚膜血清型与毒力基因检测结果及分布见表2。

注：M为DNA 标志物 DL2000；1～6为血清型，分别为K1(1 283 bp)、K2(641 bp)、K57(1 037 bp)、K54(881 bp)、K5(280 bp)和K3(549 bp)；7为阴性对照；8～12为毒力基因，分别为rmpA(536 bp)、fimH(688 bp)、Aero(556 bp)、mrkA(609 bp)和wabG(683 bp)

图1PCR扩增结果

表2 荚膜血清型与毒力基因检测结果[n(%)]

2.5不同标本中荚膜血清型和毒力因子的分布 血液和痰中均检测到5个毒力荚膜血清型K1、K2、K5、K54和K57，尿液中未检出K1和K5血清型，血液、尿液和痰中共检出高毒力血清型82株。血液、尿液和痰中均检测到5种毒力基因rmpA、aero、mrkA、fimH和WabG，结果见表3。

表3 主要标本中荚膜血清型和毒力基因分布情况[n(%)]

2.6同源性分析结果 106株菌的质谱同源性分为A型和B型2类，A型62株占59%，B型43株占41%，其中A1亚型42株占40%、A2亚型20株占19%，同一患者感染的菌株分型结果大部分一致，65%的患者为同一型别，由同一克隆的肺炎克雷伯菌引起多部位感染菌株间的同源性较小。

3 讨 论

肺炎克雷伯菌为院内感染的重要条件致病菌，会造成呼吸道、泌尿道、消化道、血流及皮肤软组织等多部位感染[2-3]。本研究共收集宣武医院2017-2018年两年间发生多部位肺炎克雷伯菌感染患者34例，分离肺炎克雷伯菌菌株106株。肺炎克雷伯菌主要分布于ICU、普外科和神经内科(78%)，其他科室较少(22%)，标本主要来源于血、痰和尿。年龄65岁以上者占75%，男性(70.7%)明显多于女性(29.3%)。多部位感染患者的临床资料分析血液和肺部同时感染的患者占比重较高，与其他研究结果一致[3]，特别是hvKP引起感染时，菌株可更早地从血液中分离，有引起转移性感染的危险，提示临床应引起重视。hvKP多在无侵入操作史的情况下导致感染，并可更早地从血液中分离出来，最常引起同一患者血液和肝脏感染[3]；非hvKP多在侵入性操作导致机体黏膜屏障受损后引起血-胆和血-肺部感染，血液中细菌的分离多发生在侵入性操作后。回顾性分析临床资料，发生院内病死率为40%，主要发生在高龄、入住ICU、重症胰腺炎等患者，与其免疫力低下、基础疾病多、病情严重等相关。

黏液丝试验检出高黏性肺炎克雷伯菌仅占22%，而黏液丝试验阴性占78%，提示致多部位感染患者分离的肺炎克雷伯菌以非高粘表型为主。荚膜血清型检出了包括K1、K2、K5、K54和K57在内的多种高毒力型别，其中以K2为主(42%)，不同标本中均检测到不同比率的荚膜血清型型别(表3)。分离的肺炎克雷伯菌携带rmpA、aero、mrkA、fimH和WabG等多种毒力基因[12-13]，同时检测到3种及以上者占47%，血液、尿液和痰中均检测出多种毒力因子。

同源性分析对流行病学调查具有十分重要的意义，目前常用的被广泛认同的基因分型方法有脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型、肠道细菌间重复序列PCR分型和随机扩增DNA多态性等分子生物学手段，但受限于其耗时长、成本高、操作繁琐等，难以实现快速同源性分析。MALDI-TOF MS是近年来飞速发展起来的一种新型微生物鉴定技术，通过分析不同种属微生物保守且独特的蛋白峰进行种内分型[10-11,14]，可在几分钟内完成对可疑细菌鉴定的同时进行同源性分析，本实验研究的106株菌的同源性分析显示，分为两大群，同时A群又分为两亚群，包括A1(40%)、A2(19%)和B(41%)型，以A型为主要流行株。65%的同一患者感染的菌株分型结果一致，但由同一克隆的肺炎克雷伯菌引起多部位感染菌株间的同源性较小，聚类分析与耐药菌株同源性相比较分散[13]。利用质谱技术能及时对病原监测、感染源监测、传播途径调查等，符合院内感控工作对病原菌流行病学分型快速有效的要求，可为医院感控工作及时提供实验室依据。但质谱同源性分析依据蛋白质谱图分类，与传统分型方法多基于核酸分析存在明显差异，相关研究相对较少，需分析多重影响因素综合分析[11]。本研究发现虽然同一患者多个部位都分离出同种的肺炎克雷伯菌，但菌株并不一定同源，这就为临床和微生物工作者对感染的分析提供了证据：应考虑同一患者感染同种不同型菌株的可能。因此在微生物工作中不应因鉴定为同一种细菌而省略了药敏试验，在临床治疗上也应全面考虑抗菌药物选择的问题。

4 结 论

本院分离出的致多部位感染肺炎克雷伯菌主要分布在ICU病房，K2血清型是本院最常见的荚膜血清型，同时检测到多种毒力基因。虽然同一患者血液和其他部位均可分离出肺炎克雷伯菌，但细菌的分子型别存在差异，需结合细菌的同源性分析和其他指标综合判断。hvKP多在无侵入操作史的情况下导致感染，并可更早地从血液中分离出来，值得临床注意。