Septin9基因甲基化在食管癌诊断中的应用价值*

徐银海，孙静芳，李世宝，朱迎星，胡 阚，马 萍

(徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州 221002)

食管癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为25%～30%[1]。据GLOBOCAN 2018统计世界范围内每年大约有新发病例572 000例，死亡病例508 100例[2]。我国食管癌每年新发病例477 900例，死亡病例375 000例[3]。早期诊断是减少食管癌病死率最有效的手段，研究显示，早期食管癌患者手术治疗后5年生存率可达85%[4]，但食管癌的临床症状不典型且目前没有有效的标志物来早期发现食管癌的存在，大部分患者在确诊时已经是晚期，错过了最佳治疗时期。因此，亟需一种敏感、特异的标志物对食管癌进行诊断和预后跟踪。

近年来，表观遗传学机制备受研究者的关注，其中，DNA发生异常甲基化是肿瘤常见的表观遗传学改变。Septin9基因广泛存在于人类细胞中，在细胞分裂中起关键作用[5]。已有研究表明，在多种恶性肿瘤中存在Septin9基因甲基化改变，如结肠癌[6-8]、胃癌[9]、卵巢癌[10]等，但其在食管癌中的研究甚少涉及。因此，本研究旨在通过对外周血Septin9 基因甲基化的检测，评估其在食管癌诊断中的价值，以期发现一种相对敏感、特异的标志物对食管癌进行辅助诊断。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年1-12月在徐州医科大学附属医院初诊的食管癌患者(实验组)31例，其中男23例，女8例，健康人群20例(对照组)。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。其中食管癌的诊断均由徐州医科大学附属医院病理学确诊报告且资料完整。食管癌患者的血样采集均为术前血样，且未经过相关的治疗。

1.2仪器与试剂 ABI7500荧光PCR扩增仪(美国，ABI公司)；人Septin9基因甲基化检测试剂盒(苏州，天隆科技)

1.3血样采集与制备 取外周血10 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，采样后立即处理。全血1 600 g离心10 min，转移血浆至新的15 mL离心管，分离血浆再1 600 g离心10 min，将上层血浆转移至新的离心管中-80 ℃保存。

1.4检测方法 依据试剂说明书依次加入蛋白酶K溶解液、裂解液、磁珠、提取漂洗液、洗脱液等进行血浆样本DNA提取，依次加入转化试剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化漂洗液、洗脱液对提取的血浆样本DNA进行亚硫酸盐转化，依据试剂说明书加入PCR Mix、DNA聚合酶配制反应体系，加入样本DNA进行PCR扩增定量等步骤。

1.5结果判读 检测样本FAM通道的Ct值<50且内标检测结果Ct值≤32判为阳性；检测样本FAM通道的Ct值无数值且内标VIC通道的Ct值≤32，结果判为阴性；若检测过程中内标检测无数值或Ct值>32，样本DNA纯度或浓度过低，则检测结果无效，应当重新采样检测。

1.6统计学处理 所有数据采用SPSS18.0软件进行分析，计数资料采用频数和百分率表示，采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价Septin9对食管癌的诊断价值。

2 结 果

2.1两组一般资料比较 实验组和对照组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

注：-表示无数据

2.2Septin9对食管癌的诊断价值 Septin9诊断实验组阳性率为67.7%(21/31)，对照组阳性率为0(0/20)，差异具有统计学意义(χ2=23.03，P=0.000)。见表2。Septin9诊断食管癌的ROC曲线下面积为0.839，灵敏度为67.6%，特异度为100.0%，见图1。

2.3Septin9与食管癌临床病理分期的关系 Septin9的检出率在食管癌的分化程度、肿瘤浸润程度、淋巴结转移及临床分期之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 Septin9基因甲基化在食管癌患者检出结果(n)

注：1表示Septin9对食管癌的诊断能力；2表示参考线

图1Septin9诊断食管癌的ROC曲线

表3 Septin9基因甲基化与食管癌临床病理分期之间的关系

3 讨 论

Septin9基因广泛存在于人类细胞中，编码 GTP 结合蛋白，在细胞分裂中起关键作用[5]。越来越多的研究表明多种肿瘤的发生发展涉及表观遗传学的异常改变，而DNA甲基化是其中常见的表观遗传学改变。自2008年LOFTON等[11]首次报道Septin9基因甲基化可以作为筛查结肠癌的指标以来，国内外多位学者发表了一系列的关于Septin9基因甲基化筛查结肠癌的文章[6-8,12]，刘彦魁等[8]的研究发现Septin9基因甲基化不仅发生在结肠癌中，在胃癌、食管癌等其他恶性肿瘤中也可检测到，但目前关于Septin9在食管癌中的研究甚少。

本研究结果显示Septin9基因甲基化可作为食管癌筛查的一个指标：以病理结果为金标准，其在筛查食管癌中的ROC曲线下面积为0.839，灵敏度和特异度分别为67.6%和100.0%，与健康对照组比，有显著差异。刘彦魁等[8]对27例食管癌进行Septin9基因甲基化检测，阳性率为25.9%，低于本研究的67.6%，这可能与患者之间的差异性及检测方法有关，进一步扩大样本量对其在食管癌中的检测效能进行验证。在本研究中，外周血Septin9基因甲基化与食管癌的各临床病理特征之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示Septin9基因甲基化的检出可能与肿瘤的临床病理特征之间无直接的联系。刘彦魁等[8]的研究结果显示Septin9基因甲基化Ⅰ、Ⅱ期患者的发生比例低于低于Ⅲ、Ⅳ期患者，提示Septin9基因甲基化的发生随着临床分期的进展而增加，CHURCH等[13]得到与此类似的研究结果。但本研究结果未发现肿瘤的临床病理特征影响Septin9基因甲基化状态，可能是不同检测试剂盒的灵敏度和特异度对检测结果造成的不同影响，也有可能是本研究的样本量较少，使结果相对局限，未能显示出Septin9基因甲基化与肿瘤临床病理特征之间的关系。除样本量较少这一不足之外，食管癌没有相应的肿瘤标志物做对照也是一处不足，没有体外诊断的其他指标来做比较，仅Septin9一个指标来诊断食管癌，说服力欠妥。

虽然本研究存在一定的局限性，但其在食管癌患者中相对高的灵敏度和特异度提示Septin9基因甲基化可以作为食管癌的一个初筛指标，以辅助其早期诊断，适当地弥补食管癌目前临床缺乏特异肿瘤标志物的缺陷。

综上所述，本研究结果证明检测外周血中Septin9基因甲基化状态可作为辅助筛查食管癌的肿瘤标志物，作为一种新的无创的食管癌的筛查方法，其无创、采样方便、灵敏度和特异度较强的优势是比较适合辅助食管癌临床筛查的。