肺炎链球菌荚膜教学标本的制作方法研究

王燕 曾燏 张富斌

[摘要]目的 探索并優化肺炎链球菌荚膜教学标本片的制作条件和染色过程，以期找到适合我校荚膜教学标本片需求的制作和保存方法，提升微生物实验课堂的教学质量。方法 将肺炎链球菌传代活化后制成悬液，以腹腔注射法（0.2 ml悬液）感染10只昆明小鼠并传代培养，提取发病待濒死小鼠的腹腔液涂片，分别使用石炭酸复红染色法和改良Hiss荚膜染色法对其进行染色，从菌体形态、数量、荚膜大小、染色效果等方面综合比较两种染色方法的差异。最后将镜检合格的标本用中性树胶封固，贴上标签后保存备用。于2018年12月，抽查我校2017年12月使用改良Hiss荚膜染色法所染制的35片标本片，评估标本片的质量。结果 随着传代的进行，受染小鼠体内的肺炎链球菌增多，荚膜增大。传代两次即可见宽大的荚膜，且第二次传代感染实验小鼠的发病时间明显缩短，两次感染发病时间分别为10～12 h和8～10 h。同传统的石炭酸复红染色法比较，改良Hiss荚膜染色法所染制的标本，背景均匀，染料颗粒少，菌体呈现深紫色，同淡紫色背景对比明显。同时，抽查已保存1年的改良Hiss荚膜染色法所染制的标本共35片，抽查结果表明，改良Hiss荚膜染色法制作、保存的标本荚膜仍清晰可见，无褪色和霉变现象，标本片完好率达到100%。结论 在实际教学中，小鼠体内传代两次即可观察到明显的荚膜，改良Hiss荚膜染色法的染色效果优于传统的石炭酸复红染色法，且封片保存的标本可反复多次使用，能满足我校教学需要。

[关键词]肺炎链球菌;荚膜;石炭酸复红染色;改良Hiss荚膜染色法;实验教学

[中图分类号] R378.12          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）12（c）-0025-04

[Abstract] Objective To explore and optimize the preparation conditions and dyeing process of making streptococcus pneumoniae capsule teaching specimens， in order to find the most suitable preparation and preservation methods for the requirements of making and preserving capsule teaching specimens of our school， so as to eventually improve the quality of experimental teaching class in Microbiology. Methods To make the suspension of streptococcus pneumoniae followed the process of subculture and activation， ten Kunming mice were infected by intraperitoneal injection （0.2 ml suspension） and subcultured. Peritoneal fluid of mice were extracted before the mice dying for smear， and carbonic acid complex red staining and modified Hiss capsule staining were used to stain the capsules， respectively. The differences between the two staining methods were compared between the carbonic acid complex red staining and modified Hiss capsule staining in terms of morphology， quantity， capsule size and dyeing effect. Finally， the qualified specimens were sealed with neutral gum， labeled and stored for future use. In December 2018， 35 specimens dyed by the modified Hiss capsule staining method in December 2017， were sampled to evaluate the quality of the specimens. Results With the passage， the number of streptococcus pneumoniae increasing， the size of capsule become enlarged. And the wide capsule could be seen in only two passages， meanwhile， the infection onset time in the second was obviously shorter than that in the first one. The infection onset time of the two infections passages was 10～12 h and 8～10 h， respectively. Compared with the carbonic acid complex red staining method， the modified Hiss capsule staining method showed that the specimen had a uniform background， fewer dye particles， dark purple cells， and obvious contrast of capsule with light purple background. At the same time， a total of 35 samples were dyed by the modified Hiss capsular staining method， which had been preserved for 1 year. The results showed that the capsule of the specimens preserved by the modified Hiss capsular staining method was still clearly visible， without fading or mildeutriation， and the percentage of specimens in good condition was highly up to 100%. Conclusion During the practical teaching， the obvious capsule can be observed in mice with only two passages and the dyeing effect of the modified Hiss capsule staining method has obviously advantages than the carbonic acid complex red staining method. And the sealed specimen can be reused many times. All of these merits can completely meet the need of experimental teaching in our college.

[Key words] Streptococcus pneumoniae; Capsule; Carbonic acid complex red staining; Modified Hiss capsule staining; Experimetal teaching

细菌教学标本片质量的优劣直接关系到微生物实验教学质量的好坏。优质的细菌教学标本片不仅能清晰地呈现出细菌的形态结构特征，也能激发学生的学习热情，从而有效促进课堂教学效果的提升[1]。荚膜是细胞壁外包绕的一层粘液性物质，具有粘附和抗吞噬的作用，也是病原菌重要的毒力因子，在细菌的鉴定中有重要的意义[2-4]。一般而言，细菌荚膜易形成于动物体内或含有血清的培養基中，而在普通培养基或连续传代过程中常会减少，甚至消失[5]。同时荚膜对一般的碱性染料亲和力低，不易着色，且不同种类的细菌荚膜，其染色效果也差异较大[6-7]。目前，我校微生物实验形态观察的细菌教学标本片主要购买于厂家，质量参差不齐，放置一段时间后常因褪色、霉变等原因，导致细菌的荚膜难以观察，不利于课堂教学工作的顺利开展。本研究以肺炎链球菌为对象，针对荚膜教学片制作过程中的操作步骤、染色方法、染色成功率、保存时间等方面开展研究，探索并优化肺炎链球菌荚膜教学标本片的制作方法和染色效果，以期找到适合我校荚膜教学标本片的制作和保存方法，从而提升微生物实验课堂教学质量，现报道如下。

1对象与方法

1.1实验仪器

DM500型显微镜ICC50型成像系统（徕卡生物技术有限公司）;1300系列A2型生物安全柜（赛默飞实验室仪器设备公司）;SPX-250B型生化培养箱（上海博讯实业有限公司）;LDZX-50KBS型高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）。

1.2实验器材

1、5 ml注射器（江西洪达医疗器械集团有限公司）;解剖剪、解剖盘（上海医疗器械厂）;载玻片、盖玻片（海荣实验器材厂）;接种环。

1.3实验材料

肺炎链球菌49619（来源于川北医学院附属医院检验科），18～22 g重昆明小鼠10只[来源于川北医学院实验动物管理中心，许可证编号：SCXK（川）2013-18]。所有实验动物的使用均得到川北医学院实验动物伦理管理委员会的同意。

1.4实验试剂

碘酒酒精消毒剂（自制）;95%酒精（成都蜀都实业有限公司）;石碳酸复红染液（自制）;印度墨水（南京都莱生物）;结晶紫染液（自制）;20%硫酸铜水溶液（自制）;中性树胶（上海标本模型厂）。

1.5实验方法

1.5.1菌种复苏及荚膜诱导

将肺炎链球菌接种在血琼脂平板培养，并传代2次后，在平板内加入5 ml的无菌生理盐水洗下菌苔，混匀后制得菌悬液，经测定菌悬液浓度为4×108 CFU/ml。

用1 ml的注射器取0.2 ml菌悬液，以腹腔注射法感染小鼠，并做好记号，将小鼠放置在鼠笼内喂养观察，记录小鼠的发病状态及时间。在小鼠发病濒死前，注射无菌生理盐水2 ml至小鼠腹腔，并揉匀腹部，以脱臼法处死小鼠，解剖腹部，取腹腔液0.2 ml再次感染健康小鼠。

每传代1次取腹腔液涂片，自然干燥后荚膜染色。

1.5.2荚膜染色

1.5.2.1石炭酸复红染色法  加石炭酸复红染液于涂片处染色1～2 min，水洗，自然干燥;在载玻片一端加一滴墨水，用一块边缘光滑的载玻片与墨水接触，以匀速推向另端，涂成均匀的一薄层，自然干燥后显微镜观察 。

1.5.2.2改良Hiss荚膜染色法  在涂片处覆盖滤纸片，滴加结晶紫染液染1 min，用200 g/L硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干后，显微镜观察。

1.5.3镜检封片  抽检实验结果，并用中性树胶封固[8]。取1滴中性树胶，滴在涂片染色区，盖玻片倾斜着缓缓放下去，防止气泡产生，然后轻压盖玻片使树胶呈一薄层，待树胶干燥后贴上标签保存。

1.5.4标本片抽查

于2018年12月，抽查我校2017年12月使用改良Hiss荚膜染色法所染制的已保存1年的某批次标本片（共35片），评估标本片的质量。

2实验结果

2.1实验小鼠的感染观察、发病时间及标本制作

经腹腔注射肺炎链球菌感染后，实验小鼠的活动欲望下降，活动量明显减少，挤缩在笼子一侧（图1A）。第一次传代感染实验小鼠的发病时间为10～12 h，而第二次传代感染实验小鼠的发病时间缩短为8～10 h，对比两次传代感染的发病时间可知，第二次传代感染实验小鼠的发病时间明显缩短。小鼠濒死前，取腹腔液涂片（图1B），自然干燥后染色镜检。

2.2两种荚膜染色方法效果的比较

用石炭酸复红染色法和改良Hiss荚膜染色法对两次传代感染的荚膜涂片进行染色，结果提示，两种染色方法的染色效果有较大差异，其中石炭酸复红染色法的镜检结果，背景颗粒杂质多，标本被墨汁覆盖，难以观察到菌体及荚膜的形态。而改良Hiss荚膜染色法镜检结果显示，标本背景呈现淡紫色，菌体紫色，菌体周围的荚膜以不着色的状态衬托出来（图2A、B）。

进一步比较两次传代的肺炎链球菌形态，染色镜检结果显示：两次传代的肺炎链球菌在菌体形态、数量和荚膜大小上均存在差异，其中第一次的细菌量相对较少，菌体球形，矛头状，钝端相对，呈短链状排列，荚膜较小（图2A），而第二次荚膜诱导后可见涂片中细菌较多，菌体呈球形，成双排列，荚膜明显增大（图2B）。

2.3标本片抽查

于2018年12月，抽查我校2017年12月使用改良Hiss荚膜染色法所染制的已保存1年的35片标本片，结果发现，本改良Hiss荚膜染色法制作保存的标本荚膜仍清晰可见，颜色如保存之初，无褪色和霉变现象，标本片完好率达到100%。

3讨论

荚膜是细菌致病重要的毒力因子和鉴别依据，在微生物实验教学中有重要的意义[9-10]。肺炎链球菌定植在正常人群的鼻咽部，免疫力下降时引起疾病，是细菌感染性疾病的主要致病菌，荚膜是它的重要致病物质[11-12]。因此肺炎链球菌及其荚膜的形态是微生物实验教学中的重点观察对象。由于荚膜不易被普通染色方法染色，通常采用如石炭酸复红染色法等负染色法来将其衬托[13-16]，但此类方法仍存在实验步骤繁杂、耗时长、染色效果不佳，且保存时间短等诸多不足，较大地影响了日常实验教学效果。本研究通过改良Hiss荚膜染色法对肺炎链球菌荚膜染色镜检，简化了操作步骤，结果显示，通过改良Hiss染色法对肺炎链球菌荚膜染色观察到的菌体呈深紫色，背景呈淡紫色，荚膜包饶着菌体以透明圈呈现，形态特性明显，且背景杂质少，易于观察，满足优良教学片所需特征。

为增多肺炎链球菌量，增厚细菌荚膜，增强细菌致病力，通常是通过人工传代感染实验小鼠的方式来实现[17-18]。本研究比较了两次连续传代感染的实验小鼠的染色镜检结果发现，同第一次传代感染小白鼠相比，第二次传代感染小白鼠的发病时间明显更短，且荚膜增厚明显，细菌数量更多。因此建议在日常教学制片过程中，传代两次感染后即可开始染色，其典型的菌体和荚膜形态均可在显微镜下观察到。

在染色标本的保存上，本实验中所用的中性树胶是一种天然树胶，干燥后凝固成无色透明物，用于玻片的封片保存可有效地保护染色区域免受外界环境的干扰，1年前制作的标本片完好率高达100%，因此，本方法制作的标本可多次使用而不褪色、霉变，适宜长期保存。

本研究以肺炎链球菌为对象，针对荚膜教片制作过程中传代次数多、染色方法多、染色效果不佳、不易保存等相关问题开展探索性研究。实验结果显示，同传统方法相比，本研究中所采用的改良Hiss荚膜染色方法不仅简化了操作步骤，提高了荚膜染色的成功率，同时也延长了标本片的保存时间。该方法所批量制作、保存的荚膜染色片，能较好地满足本校微生物实验教学的需求，也对科研及临床检验具备一定的推广价值。

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（收稿日期：2019-03-12  本文编辑：孟庆卿）