广东地区水禽大肠杆菌血清型鉴定

张济培，韦庆兰，谭华龙，陈建红

（1.佛山科学技术学院生命科学院，广东 佛山 528231；2.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

禽大肠杆菌病是由大肠埃希菌的某些致病性菌株或某些致病血清型引起的一种非接触性传染病。表现为大肠杆菌性败血症、肠炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、肝周炎、眼炎和大肠杆菌性肉芽肿等多种症状。防治大肠杆菌病的主要措施是应用疫苗及抗生素。制备疫苗的最大困难是大肠杆菌血清型众多，仅国内报道就有80余种，并且不同动物及不同地区流行的主要血清型不完全一样。O抗原又称菌体抗原，是大肠杆菌重要的抗原，调查本地区水禽源大肠杆菌优势O血清型对制备疫苗有着重要的意义。本试验通过对广东不同地区水禽源大肠杆菌鉴定O血清型，获得了本地区流行的优势血清型,为水禽源大肠杆菌病的防控提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 251株水禽源大肠杆菌分离自广东不同地区临床发病水禽，肇庆地区采集121株，佛山地区采集44株，广州地区采集22株，江门地区采集44株，清远地区采集20株。其中从以卵黄性腹膜炎为主要发病特征的水禽上分离到169株大肠杆菌，从以肝周炎为主要发病特征的水禽上分离到82株大肠杆菌，全部菌株由本实验室保存。

1.2 血清及主要材料 23种常见的大肠杆菌O抗原单价血清（O1、O2、O3、O6、O20、O33、O36、O43、O45、O53、O65、O71、O73、O74、O78、O86、O88、O93、O103、O106、O107、O143和O145）为中国兽医药品监察所提供。麦康凯培养基、营养琼脂培养基和LB液体培养基为广东环凯生物技术有限公司产品。96孔U型板为广州健阳生物科技有限公司产品。

1.3 血清型鉴定 结合文献报道的微量凝集法[1]和中国兽医药品监察所推荐的玻片凝集法进行大肠杆菌血清型鉴定。

（1）抗原的制备：从麦康凯培养基上挑取砖红色单个菌落接种于LB液体培养基中，置37℃培养24 h，将LB液体培养基涂布于营养琼脂培养基上。37℃培养24 h后，用0.5%石炭酸生理盐水洗下营养琼脂培养基上培养物，121℃高压2 h，制成菌体抗原。再以4000 r/min离心15 min，并用0.5%石炭酸生理盐水洗涤离心2次，用0.5%石炭酸生理盐水重悬沉淀物，并进行比浊，以确定菌体抗原的浓度。

（2）微量凝集法：将大肠埃希菌单因子血清溶解于5 mL 0.5%石炭酸生理盐水中，取3 mL血清作10倍稀释，标记待用。取96孔U型板从每行第2孔开始加50μL 0.5%石炭酸生理盐水至第8孔。然后向第1孔和第2孔分别加入50μL 10倍稀释血清，从第2孔中吸取50μL加入第3孔，依次进行倍比稀释，稀释到第7孔后，弃掉50μL，每行加入不同血清。除了每行第7孔外，都加入制备好的菌体抗原。用保鲜膜将96孔U型板密封，37℃孵育1.5 h～2 h后，观察并记录结果。结果判断标准：在黑色背景下，以是否有片状凝集，同时以上清液清澈为凝集反应完全标准。

（3）玻板凝集反应：通过微量凝集法鉴定，可能会出现一个抗原有几个与之反应的血清，此时就需要将菌体抗原和疑似未稀释血清各取10μL在洁净的玻板上混匀，同时以菌体抗原与0.5%石炭酸生理盐水混合物作对照，反应组半分钟内出现明显凝集，而对照组无凝集者，则判断为阳性。

2 结果

2.1 血清型地区分布比较 251株水禽源大肠杆菌中，有244株已确定血清型，占分离株的97.2%，而7株未能定型，占分离株的2.8%。优势血清型为O2、O20、O65、O78和O86，占分离株的54.7%（见表1）。其中O78血清型菌株有35株，占分离株的13.9%。肇庆地区优势血清型为O20、O65、O78和O86，占肇庆分离株的44.7%；佛山地区优势血清型为O2、O65和O78，占佛山分离株的54.5%；广州地区优势血清型为O78，占广州分离株的40.9%；江门地区优势血清型为O2和O86，占江门分离株的45.4%；清远地区优势血清型为O86，占清远分离株的30.0%。

2.2 发病特征不同大肠杆菌血清型分布比较251株水禽源大肠杆菌中，97%（164/169）的以卵黄性腹膜炎为发病特征的菌株确定了血清型，97.5%（80/82）的以肝周炎为发病特征的菌株也确定了血清型（见表1）。以卵黄性腹膜炎为发病特征的菌株优势血清型为 O2、O20、O65、O78和 O86，占以卵黄性腹膜炎为发病特征的菌株的45.6%。以肝周炎为发病特征的菌株优势血清型为 O2、O65、O78和O86，占以肝周炎为发病特征的菌株的68.3%。

表1 251株广东地区水禽源大肠杆菌血清型分布情况

3 小结与讨论

用23种常见的大肠埃希菌O因子血清鉴定251株水禽源大肠杆菌。结果表明，97.2%（244/251）的分离株已确定血清型，尚有2.8%（7/251）的分离株未能定型。优势血清型为 O2、O20、O65、O78和 O86，占分离株的54.7%。其中O78血清型菌株有35株，占分离株的比率最高，鉴定率为13.9%，O86、O65、O2和O20次之。肇庆地区优势血清型为O20、O65、O78和O86；佛山地区优势血清型为O2、O65和O78；广州地区优势血清型为O78；江门地区优势血清型为O2和O86；清远地区优势血清型为O86，表明同一省内不同地区的水禽源大肠杆菌优势血清型不尽相同。

王传禹[2]等报道，云南地区鸭源致病性大肠杆菌优势血清型为O78和O132；黎杰虹[3]等报道，佛山禽源大肠杆菌以O78血清型为主；于学辉[4]等报道，四川、重庆和云南地区的鸭源致病性大肠杆菌优势血清型为O93、O78、O92和 O76；李玉文[5]等报道，辽宁省禽大肠杆菌优势血清型为O78和O109；刘远飞[6]等报道，辽宁省禽大肠杆菌优势血清型为O78、O1、O8和O143。由此说明O78不仅是鸡源大肠杆菌优势血清型，而且是水禽源大肠杆菌优势血清型，O78血清型禽大肠杆菌流行范围广泛。王秀梅[7]等报道，广东地区猪源致病性大肠杆菌优势血清型为O8和O64；姜卫东[8]等报道，广东省仔猪腹泻大肠杆菌优势血清型为O119、O60、O75和 O141、O20、O8和 O101；王文豪[9]等报道，华南地区致病大肠杆菌优势血清型为O107、O101、O9、O60和 O26；文英[10]报道，西宁市宠物源致病性大肠杆菌优势血清型为O157、O64、O10、O119、O24、O137、O147和O149。以上数据表明，不同地区、不同动物来源的大肠杆菌优势血清型差异明显；相同地区、不同动物来源的大肠杆菌优势血清型也有明显差异；不同地区、相同动物来源的大肠杆菌优势血清型存在差异，但也存在相同的血清型。说明我国大肠杆菌血清型种类众多、分布广泛，其分布可能与动物种类有关。

有文献报道[11]，血清型与临床发病型有直接关系，认为败血症常为O2、O78、O1和O50血清型所致；肉芽肿常为O4、O8、O9和O6；出血性肠炎常为O111、O5和O88；关节炎、腹膜炎、输卵管炎常为O2；眼炎常为O88、O18等。本试验以卵黄性腹膜炎为发病特征的菌株优势血清型为O2、O20、O65、O78和 O86；以肝周炎为发病特征的菌株优势血清型为O2、O65、O78和O86。说明O2、O65、O78和O86血清型大肠杆菌可能是临床发生卵黄性腹膜炎症和肝周炎症的重要原因。引起临床发生腹膜炎的大肠杆菌血清型不再是单一的以O2为主，现在是多个血清型都能引起腹膜炎，临床大肠杆菌血清型呈现越来越复杂的趋势。

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