不同阶段原发性胆汁性胆管炎患者外周血T淋巴细胞亚群变化

李卓敏，张牧之，王晓宁，刘 晴，郑芳芳，古 媛，韩 旭，田 野，聂秋燕，张然星，闫惠平，谭延国△

(1.首都医科大学附属复兴医院检验科，北京 100038；2.首都医科大学临床检验诊断学系，北京 100038；3.中国中医科学院望京医院检验科，北京 100102；4.首都医科大学附属北京佑安医院感染与免疫研究中心，北京100061)

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种原因未明的慢性胆汁淤积性疾病，患者以碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷丙酰转肽酶(GGT)升高为主，丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸基转移酶(AST)及免疫球蛋白(主要为IgM)可见中等程度升高，胆红素升高、清蛋白下降、凝血酶原时间(PT)延长常为疾病进展的表现。PBC的发病机制尚不明确，但遗传易感性及环境因素是其主要发病机制之一[1]。已有研究表明，PBC患者受累胆管周围伴随淋巴细胞浸润，可见CD4+T、CD8+T细胞及B细胞，而且在PBC患者外周血及受累胆管周围均已被证实有丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)抗原特异性的CD4+的自身反应性T细胞的存在。CD4+CD25+T细胞具有免疫抑制功能，可抑制自身反应T细胞的增殖。很多学者提出PBC患者自身反应T细胞与免疫调节性T细胞(Treg)的失衡，可能是PBC的致病因素之一。本研究分析PBC患者外周血CD4+T细胞、Treg水平与肝功能指标的相关性，重点探讨不同临床分期及治疗前后PBC患者外周血CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞在其病情进展及机体免疫平衡维持中的可能作用，以尝试从免疫调节角度为PBC的早期治疗提供新的策略。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2009年6月至2013年12月于北京佑安医院初次住院治疗且后期随访依从性较好36例PBC患者(PBC组)，选取该36例患者随访过程中(治疗时间均大于或等于12个月)不同时间点标本进行下述研究。研究对象符合2009年美国肝病学会(AASLD)制定的PBC诊断标准，同时排除病毒性肝炎，酒精性及药物性肝损害[2]。健康对照组均为北京佑安医院及首都医科大学的健康献血志愿者，共计15例。所有标本的采集均符合北京佑安医院科研伦理委员会要求且已签署知情同意。

1.2仪器与试剂 荧光抗体抗CD4-FITC、抗CD25-percp和FoxP3-PE购自BD公司，RPM1640培养基购自北京Hyclone公司，二亚基甲砜(DMSO)及胎牛血清(PBS)购自Sigma公司。流式细胞仪FACS Calrbar为BD公司产品。

1.3方法

1.3.1淋巴细胞悬液的制备 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管分别采取不同时间段患者的外周静脉血且在6 h内进行实验，用淋巴细胞分离液按说明书步骤分离淋巴细胞，以RPM1640离心洗涤细胞2次，加入细胞冻存液(DMSO∶PBS=1∶9)后调节细胞浓度，分装冻存入液氮以备用。

1.3.2细胞染色 提取适宜细胞迅速入37 ℃水浴箱进行复苏，转移至10 mLR10(RPMI1640∶PBS=9∶1)中离心弃上清，以5 mL R10重悬后计数细胞及存活率(10 μL细胞悬液及10 μL 2%台盼蓝混合)，37 ℃孵箱培养。取培养的细胞，加PBS调节浓度为107/mL后加100 μL入BD流式管中同时加入CD4及CD25抗体各5 μL，避光染色20 min后PBS洗涤离心弃上清，加入Fix/Perm液1 mL破膜后加入FoxP3抗体2.5 μL染色30 min，PBS洗涤后2%多聚甲醛固定，待测。

1.3.3流式细胞仪检测及分析 染色后细胞在流式细胞仪上检测，用Cell Quest软件获取数据后然后分别用Cell Quest及Flowjo软件分析结果。

2 结 果

2.1流式实验分析不同组别间CD4+T细胞及CD4+CD25+FoxP3+Treg水平 比较36例随访依从性较好PBC患者治疗前时间点细胞与15例健康对照外周血单个核细胞中CD4+T细胞及CD4+CD25+FoxP3+Treg水平，可见PBC患者在熊去氧胆酸治疗前表达CD4+CD25+FoxP3+Treg水平显著低于健康对照组，CD4+T细胞数量未见显著变化，见表1。

表1 两组CD4+T及CD4+CD25+FoxP3+Treg水平比较

注：*表示治疗前的例数

2.2CD4+T细胞、Treg水平与血清生化指标相关性分析 36例治疗前PBC患者的CD4+T细胞、Treg水平与相应时间点的血清生化值的相关性见表2，可见PBC患者外周血Treg水平与ALP(r=0.257、P=0.03)、IgM(r=0.241、P=0.045)等生化指标呈正相关；CD4+T细胞水平仅与年龄呈负相关(r=-0.252，P=0.033)。

2.3不同临床阶段PBC患者及治疗前后Treg水平比较分析 根据文献[3]将PBC患者分为4个阶段，第1阶段：无临床症状且生化检查正常，AMA阳性，病理上有PBC表现；第2阶段：无临床症状但可见肝脏生化异常；第3阶段：出现临床症状，如乏力、瘙痒等；第4阶段：出现肝功失代偿征象。因第1阶段的PBC患者在临床较难发现，故本研究中的36例患者分别涵盖第2阶段(9例)、第3阶段(17例)、第4阶段(10例)患者，经方差分析可得，第2阶段患者Treg水平[(3.88±1.70)%]显著高于第3阶段患者[(2.66±1.13)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。各阶段PBC患者熊去氧胆酸治疗前后Treg%比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4不同疗效PBC患者治疗前后Treg水平比较 巴塞罗那标准判断患者应答状况：PBC患者经过熊去氧胆酸治疗1年后ALP下降40%或降至正常值范围说明患者对熊去氧胆酸应答较佳[4]。根据该标准将36例PBC患者分为无应答组18例，应答良好组18例。经分析后可见不同疗效PBC患者组内及组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3，似乎可认为熊去氧胆酸治疗对PBC患者体内Treg%可能无太大影响。

表2 CD4+T细胞、Treg水平与生化指标相关性分析

表3 不同疗效PBC治疗前后CD4+T及Treg水平变化

3 讨 论

自1995年日本学者SAKAGUCHI等[5]首次报道CD4+CD25+Treg细胞以来，很多学者投入到这类细胞的研究中并且取得了丰硕成果。FoxP3是目前公认的CD4+CD25+Treg的特异性标志[6]。CD4+CD25+T细胞具有免疫抑制性，可抑制CD4+T、CD8+T等增殖反应及杀伤功能，从而抑制机体自身免疫反应、维持免疫稳定。PBC患者由于环境、遗传等因素影响胸腺内CD4+CD25+T细胞的产生,外周血中CD4+CD25+T细胞数量减少,其抑制功能受到严重削弱,因而产生Th1细胞驱动的有害自身免疫应答。LAN等[7]研究在PBC患者中FoxP3+Treg数量相对减少，提示其在FoxP3+Treg细胞免疫耐受缺乏。许茵等[8]及CICHOZ-LACH等[9]研究也指出PBC患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg调节性T淋巴细胞减少，免疫抑制功能减弱，对评估PBC患者细胞免疫状态和预后有重要价值。本研究中结果与上述学者研究结果类似。

有研究报道Treg细胞比例降低会促使胆管上皮细胞表达IL-17受体，与体内IL-17结合后会促进多种炎症因子的释放，加剧炎性反应，这可能是其致病机制所在[10]。本研究还显示，Treg水平似乎能够对临床分期为Ⅱ、Ⅲ期的PBC患者进行区分，但总体而言区分能力不强。

本研究中未治疗的PBC患者，其自然病程中Treg水平与ALP及IgM水平呈正相关(r=0.257、P=0.03，r=0.241、P=0.045)，这与其他研究报道结果一致[10]，RONG等[11]认为PBC患者Th17细胞、Treg细胞及相应细胞因子的异常参与自身免疫耐受的打破，在损害胆管上皮细胞中起着重要作用，同时PBC继发肝内胆管炎，导致肝脏合成TB、ALP、GGT等经胆道排泄异常。本研究后期尚需要加大病例数、细化治疗前PBC患者的临床分期和病理分期后进行进一步研究，方能得出一个更为可靠的结论。

熊去氧胆酸是目前被美国FDA批准用于PBC治疗的唯一药物，在体外实验中熊去氧胆酸被证实可抑制免疫球蛋白和细胞因子的产生、抑制淋巴细胞增殖及CD4+T淋巴细胞调节的靶细胞凋亡[12]。熊去氧胆酸治疗可使PBC患者血清胆红素及ALP、GGT等降低，肝功能恢复正常，临床症状基本缓解，使具有调节作用的CD4+CD25+T细胞逐渐恢复正常水平，本研究中仅可见升高趋势，可能与患者差异及选择例数较少有关，期待后期扩大样本量继续观察。

本实验初步研究PBC患者外周血CD4+CD25+FoxP3+T细胞在不同阶段及治疗前后水平比较，提示Treg细胞可能通过抑制体内T细胞活化来延缓病情发展和减轻肝功能损伤，故今后PBC患者除早发现早治疗外，有望通过刺激机体产生Treg细胞来达到治疗效果。

4 结 论

PBC患者与健康者对比可见外周血Treg水平显著降低且与ALP、IgM等生化指标呈正相关，且患者疾病早期体内Treg水平显著高于其他分期。熊去氧胆酸治疗似乎不影响患者体内Treg水平，仅可见应答良好患者中呈现轻微上升趋势。