甘肃省牛和羊源产气荚膜梭菌耐药性分析

吴 克，赵学亮，冯 航，王晨骁，杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens)是一种有荚膜、产芽孢的革兰氏阳性厌氧菌，菌体呈粗短杆状，广泛存在于各种动物的胃肠道及土壤、河流等自然环境当中[1-2]。该菌在适宜的条件下生长繁殖迅速，且能够产生20余种毒素，根据是否产生α、β、ι、ε、CPE、NetB等毒素可以将产气荚膜梭菌分为A～G 7个毒素型[3-4]。

作为一种重要的人畜共患病原菌，不同毒素型产气荚膜梭菌能够造成人和动物的多种疾病[5-6]。F型产气荚膜梭菌可导致人类发生食源性疾病,在发达国每年可导致上百万人食物中毒，造成巨大经济损失[7-9]。此外，产气荚膜梭菌疾病在我国牛、羊养殖中也时有发生，造成牛羊猝死和生产性能降低。A型、E型和F型产气荚膜梭菌能够引起犊牛和羔羊的肠毒血症，B型、C型和D型产气荚膜梭菌能够造成羔羊痢疾和犊牛的出血性肠炎[10]。鉴于目前我国对牛、羊源产气荚膜梭菌的研究较少，牛、羊源产气荚膜梭菌的临床用药缺乏理论参考，本次研究对采集自甘肃省规模化饲养场的牛、羊源肛拭子进行了产气荚膜梭菌分离鉴定和耐药性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 229份牛羊源肛拭子于2019年采集于自甘肃省定西市(DX)、临夏州(LX)和天水市(TS)规模化牛、羊养殖场，样品采集后保存于运输培养基，12 h内运回实验室进行产气荚膜梭菌的分离鉴定。

1.1.2 主要试剂及仪器 细菌培养96孔板，广州洁特生物过滤股份有限公司产品；胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)培养基、厌氧肉肝汤培养基、普通营养琼脂培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；2×TaqPCR StarMix，为北京Genstar生物科技有限公司产品；药品，上海源叶生物科技有限公司产品；厌氧培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 产气荚膜梭菌分离鉴定 自含有牛、羊肛拭子的运输培养基中吸取50 μL液体接种于厌氧肉肝汤中，37 ℃培养18 h，取浑浊菌液接种于TSC培养基，置于厌氧箱中37 ℃培养24 h。取TSC培养基上黑色菌落接种于50 mL/L脱纤维绵羊血琼脂平板厌氧培养24 h，挑取血平板上有溶血环的菌落对其16S rRNA序列进行PCR鉴定，并将PCR产物送至西安擎科泽西生物技术有限责任公司测序鉴定。

1.2.2 分离菌株毒素基因检测 毒素基因cpa、cpb、etx、itx、cpe、netB、cpb2的特异引物见表1，送至西安擎科泽西生物技术有限责任公司合成。水煮法提取菌株DNA，毒素基因cpa、cpb、etx、itx采用多重PCR,50 μL体系：25 μL 2×Mix预混液，cpa、cpb、etx、itx毒素上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL,双蒸水补至50 μL。反应程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，51.6 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。cpe、netB、cpb2采用单项PCR，20 μL体系：10 μL 2×Mix预混液，上、下游引物各1 μL，模版DNA 1 μL,双蒸水补至20 μL。反应程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，54 ℃1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min[11]。

表1 毒素基因PCR引物

1.2.3 分离菌株药敏试验 通过微量肉汤稀释法测定产气荚膜梭菌菌株对选用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)，在细菌用96孔板每孔加入50 μL CAMHB，并将青霉素、阿莫西林、氨苄西林、四环素、头孢他啶、万古霉素、氯霉素、美罗培南进行梯度稀释。血平板上刮取产气荚膜梭菌菌落，生理盐水稀释为麦氏浊度为0.5的菌液。每60 μL菌液与5 mL药敏接种培养液混合均匀后，按照每孔50 μL加入96孔细菌培养板，置于厌氧培养箱37 ℃培养24 h。通过观察96孔细菌培养板内产气荚膜梭菌生长情况，统计试验菌株对所选抗菌药物的MIC值，并根据CLSI抗微生物药物敏感性试验判断标准，判断试验菌株对所选抗菌药物耐药性。

2 结果

2.1 分离鉴定结果

170份羊源和59份牛源肛拭子中分离出25株和28株疑似产气荚膜梭菌菌株，分离菌株在TSC培养基上为黑色边缘整齐的圆形菌落，在血平板上为周围有单溶血环或双溶血环的半透明小菌落。镜检观察，分离菌株为革兰氏阳性边缘整齐的中等大小杆菌(图1)，16S rRNA PCR产物测序比对显示所分离菌株均为产气荚膜梭菌(图2)。本次试验牛羊源产气荚膜梭菌总分离率为23.1%，牛源产气荚膜梭菌分离率为47.5%，羊源产气荚膜梭菌分离率为14.7%。

A.分离菌株菌落(TSC培养基)；B.分离菌株菌落(血平板)；C.分离菌株镜检观察(1 000×)A.Colonies of the isolates on TSC agar; B.Colonies of the isolates on blood agar; C.Microscopic observation of the isolates(1 000×)

M.DNA 标准DL 2 000;1～7.样品；-.阴性对照；+阳性对照

2.2 毒素基因鉴定

经鉴定，53株产气荚膜梭菌全都含cpa毒素基因，36株含有cpb2毒素基因，未检测到毒素基因cpb、etx、cpe、itx和netB，本次试验所分离53株产气荚膜梭菌均为A型产气荚膜梭菌。

2.3 分离菌株MIC分布

药敏试验用53株产气荚膜梭菌对美罗培南、万古霉素、阿莫西林MIC集中于≤0.06 μg/mL～0.5 μg/mL，对青霉素与氨苄西林的MIC值集中于≤0.06 μg/mL～1 μg/mL，对氯霉素的MIC集中于0.25 μg/mL～2 μg/mL，对头孢他啶的MIC在≤0.25 μg/mL～8 μg/mL散在分布，对四环素的MIC值在≤0.25 μg/mL～32 μg/mL散在分布。53株产气荚膜梭菌对美罗培南、阿莫西林、万古霉素、头孢他啶、氯霉素均敏感，对青霉素和氨苄西林分别有11(20.8%)株和7(13.2%)株中介菌，对四环素有8(15.1%)株中介菌和13(24.5%)株耐药菌。牛源(28)与羊源(25)产气荚膜梭菌对四环素的耐药菌株为9株和4株，耐药率分别是36%和14.3%。

2.4 四环素耐药菌株进化树分析

本研究中四环素耐药菌株(DX、LX、TS)，与日本(JCM)、美国(BB、SG、MOTB、MOTT)、韩国(KSJ)的产气荚膜梭菌菌株16S rRNA序列同源性分析可见，我国甘肃省产气荚膜梭菌与日本、美国、韩国之间产气荚膜梭菌菌株同源性很低。但甘肃省定西市(DX)、临夏州(LX)、天水市(TS)之间的四环素耐药产气荚膜梭菌菌株之间具有较高的同源性(图3)。

图3 四环素耐药产气荚膜梭菌进化树分析

3 讨论

本研究自229份牛、羊源肛拭子中分离到53(23.1%)株产气荚膜梭菌，表明产气荚膜梭菌在甘肃省牛、羊养殖中具有一定程度的流行。所分离的53株产气荚膜梭菌均属于A型产气荚膜梭菌，且牛源产气荚膜梭菌分离率(47.5%)高于羊源(14.7%)，说明A型产气荚膜梭菌在所有产气荚膜梭菌中占据最大比例，且牛比羊更易携带产气荚膜梭菌，这可能导致牛受到产气荚膜梭菌疾病危害的风险性高于羊。

本次试验中，分离菌株对cpb2毒素基因的携带率达68%。CPB2毒素作为与胃肠道疾病密切相关的毒素，在多起产气荚膜梭菌引起的胃肠道疾病中被检测到[12-14]，cpb2毒素基因在甘肃省牛、羊中的高水平流行应在产气荚膜梭菌疾病的防控中引起重视。

本次研究发现甘肃省牛、羊源产气荚膜梭菌对青霉素、氨苄西林出现一定比例的中介菌株，分别为20.8%和13.2%，具有一定规模出现相应耐药菌株，并通过牛、羊产品传播给人类的风险。甘肃省牛、羊源产气荚膜梭菌主要对四环素耐药，且牛源产气荚膜梭菌对四环素的耐药率(36%)高于羊源产气荚膜梭菌对四环素耐药率(14.3%)，可以反映出甘肃省在牛饲养过程中对四环素的应用比羊频繁，且四环素耐药菌株间的高同源性，揭示了甘肃省内不同地区牛、羊养殖中四环素耐药产气荚膜梭菌具有一定程度的传播。