叶酸对母婴分离引起小鼠成年焦虑样行为影响的初探

邸 桐 赵智婕 包金风

内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特，010110，中国

焦虑症（anxiety）是最常见的精神疾病之一，主要表现为过度担心、过度兴奋和恐惧等。焦虑障碍的存在是导致其他焦虑、情绪障碍和药物滥用的危险因素。共病发展使原发性和继发性疾病的治疗更加困难，导致缓解率低、预后不良和自杀风险等。研究表明，大约三分之一的儿童在成年之前会经历焦虑症［1］。大量的临床和流行病学研究表明，焦虑与早期的不良环境有关，如母爱缺失等［2］。“都哈学说”即健康与疾病的发育起源（developmental origins of health and disease，DOHAD）学说认为在动物胚胎期和早期发育的关键窗［3］，不良的环境可引起机体组织器官结构和功能的适应性改变，从而增加其神经、内分泌、心血管等系统多种疾病的易感性。早期不良环境包括严重的大气污染［4］、儿童期遭受虐待、母亲饮酒［5］，尤其是母爱缺失［6］，可能引起神经系统疾病易感性增加，对个体身心发育产生严重损害。青少年期是一个特别重要的生命时期，研究此时应激暴露对神经系统疾病和认知功能［7］的影响十分重要。

叶酸（folic acid，FA）是一种在人体内不能自主合成，必须依靠外源性供给的水溶性B 族维生素。其在DNA、RNA 的合成和DNA 甲基化等过程中起重要的作用。孕期给予叶酸可预防新生儿神经管畸形等。近年来，研究表明叶酸缺乏可能也与多动症和孤独症等疾病的发生和发展相关。Tsuchimine S 等［8］的研究发现患有抑郁症的青少年和儿童体内叶酸明显低于对照组，但叶酸是否能够改善早期不良环境引起的成年小鼠行为和认知功能目前未见报道。母婴分离模型，被认为是对子代行为及神经发育影响研究的最有效模型之一［9］，经母婴分离的小鼠，会引起后代生理和神经递质功能的紊乱，其成年后会出现认知障碍和焦虑抑郁行为等［10］。因此本实验采用母婴分离经典应激模型，模拟人类的环境-心理应激，研究给予叶酸对早期不良环境作用下小鼠行为学和认知功能的影响，为叶酸的临床应用提供实验依据。

1 实验方法

1.1 母婴分离模型

昆明小鼠，购于内蒙古医科大学，许可证号：SCXK（蒙）2015-0001，6～8 周雌雄交配，新生鼠出生当天记作0 d。整个实验用到新生鼠的数目为41 只，同一时间新生的小鼠4 窝，其中每一窝将分成三个部分，对照组（不分离），模型组（母婴分离+生理盐水），叶酸组（母婴分离+叶酸）如Fig.1。母婴分离操作步骤为用酒精擦拭过的镊子将26 只幼崽轻柔夹出，每日小鼠分离至另一充满垫料笼子4 h，分离28 d。待小鼠长至14 d，分离同时每日腹腔注射叶酸28 d，剂量为5 mg·kg-1，体积为0.1 mL 每10 g，此为叶酸组，数目为13 只；母婴分离组数目也为13 只，同上进行分离操作每日4 h，持续28 d待小鼠长至14 d，分离同时每日腹腔注射生理盐水（normal saline，NS）0.1 mL 每10 g，注射28 d；正常组则为不进行分离操作。每周记录体重。待各组小鼠成年后约第10 周进行小鼠行为学检测。

1.2 行为学实验

1.2.1 旷场实验（open-field test，OFT）

旷场为一个50 cm×50 cm×50 cm 的不透明黑色玻璃敞箱。小鼠提前适应旷场15 min。24 h 后小鼠置于旷场的一个角，摄像机记录和评估5 min 的活动，观察小鼠进入中心区域次数及时间、直立次数。每一只鼠实验结束后，需将旷场箱内鼠的排泄物清理干净，并用75%酒精及卫生纸擦拭，晾干后方可进行下一只动物的实验，以避免气味对实验结果产生的影响。

1.2.2 十字高架实验（elevated plus maze test，EPM）

Fig.1 Process diagram

开始时手持小鼠，使其背对实验人员，放置在开臂与闭臂接合处的中心区，让小鼠面对开放臂。放置好鼠后，实验人员迅速远离，用摄像机记录5 min 内小鼠在高架十字迷宫内的活动情况，观察小鼠进入开放臂和闭合臂次数及时间、直立次数。每一只鼠实验结束后，需将迷宫内鼠的排泄物清理干净，并用75%酒精及卫生纸擦拭，晾干后方可进行下一只动物的实验，以避免气味对实验结果产生的影响。

1.2.3 新奇事物识别实验（novel object recognition test，NORT）

旷场为一个50 cm×50 cm×50 cm 的不透明黑色玻璃敞箱。小鼠提前适应旷场15 min。24 h 后放入小鼠，此时旷场内放入两个形状大小颜色相同的物体A，记录并观察。24 h 后将其中一个A 物体换成一个大小颜色相同但形状不同的物体B，摄像机记录并观察5 min，见（Fig.2）。结果以分辨指数（distinguish index，DI）来表示，分辨指数计算公式为：DI=N/（N+F）100%，式中N 为探索新物体所用的时间，F 为探索旧物体所用的时间。每只动物实验结束后，需将敞箱内的排泄物全部清理，并用75%酒精及卫生纸擦拭敞箱和物体A 或B，晾干后进行下一只动物的实验，以避免气味对实验结果产生的影响。

1.2.4 明暗箱实验（light/dark box test，LDBT）

明暗箱实验利用小鼠对明亮地方的好奇与厌恶的这种矛盾心理，评估小鼠焦虑相关行为。明暗箱为自制玻璃箱30 cm×30 cm×80 cm，不封闭的明箱占装置的3/5，完全涂成白色，而暗箱占箱子的2/5，全部涂成黑色。中间有隔断将装置分为明箱和暗箱，暗箱有顶盖。在明暗箱之间的隔断底部留有一个7 cm×7 cm 的出入口。实验开始时，将小鼠置于背朝着出入门的明箱中央，观察5 min 内小鼠的活动情况。观察指标为记录明箱停留时间和穿箱次数。每次实验开始前将明暗箱用75%酒精彻底擦拭，以排除前一个小鼠的残留气味对下一个小鼠行为的影响。

1.3 统计学方法：

所有数据均采用SPSS 22.0 进行数据分析处理，各组实验数据以均数±标准差（x-±s）表示。由于大多数行为数据不是正态分布的，所以使用了非参数检验，当接受H1时，继续用Kruskal-Wallis H 法进行两两比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。若数据服从正态分布且方差齐，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD 两两比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场实验结果

对照组进入中间格子的次数为（15.15±0.92）次，模型组进入中间格子的次数为（11.15±1.47）次，叶酸组进入中间格子次数为（17.93±1.26）次。相比于对照组，母婴分离操作可以使小鼠进入中间格子次数减少（P＜0.05）。给予叶酸后，可使小鼠进入中间格子次数显著增加（P＜0.01）；同时小鼠进入旷场中心时间，对照组（21.49±1.27）s，模型组（17.00±1.94）s，叶酸组（26.12±1.22）s。但在进入旷场时间上模型组与对照组无显著差异（P=0.1），而模型组与叶酸组有显著差异（P＜0.01）。垂直运动水平站立次数无明显差异（Fig.3）。

2.2 十字高架实验结果

Fig.2 Novel object recognition

Fig.3 Open-field test

对照组小鼠进入开臂次数百分比为（24.07±4.344）%，模型组小鼠进入开臂次数百分比为（7.943±3.731）%，叶酸组为（10.17±2.947）%（P＜0.01）。对照组在开臂时间百分比为（8.516±1.91）%；模型组（1.385±0.522 8）%，叶酸组（3.077±1.332）%。相比于对照组，模型组在开臂次数和时间明显降低（P＜0.01），但叶酸组与模型组比较无显著性差异。在竖直运动中，站立次数各组无显著性差异（Fig.4）。

2.3 新事物识别实验结果

在新事物识别实验中，对照组小鼠识别率为（0.56±0.01），模型组小鼠识别率为（0.46±0.018），叶酸组小鼠识别率为（0.54±0.018）。采用单因素方差分析可知，与对照组相比，母婴分离可使小鼠对新事物识别率显著降低（P＜0.001），而叶酸可以使小鼠对新事物识别率明显提升（P＜0.01）（Fig.5）。

2.4 明暗箱实验结果

在明暗箱实验中，对照组小鼠明箱停留时间百分比为（58.35±6.048）%，穿梭总次数为（35.25±1.656），模型组小鼠箱停留时间百分比为（22.11±3.815）%，穿梭总次数为（35.5±2.267）；叶酸组小鼠箱停留时间百分比为（50.76±9.832）%，穿梭总次数为（24.93±1.787）。采用单因素方差分析可知，在小鼠停留明箱时间上，与对照组相比，母婴分离使小鼠在明箱时间显著降低（P＜0.001），而叶酸可以使小鼠在明箱时间明显延长（P＜0.01）。在穿梭总次数上，母婴分离操作没有影响小鼠的活动能力。但发现使用叶酸后小鼠穿梭减少，更倾向于在停留在明箱（Fig.6）。

3 讨论

研究表明，叶酸对早期生活至45 岁以后的健康至关重要［11］。目前我们所知叶酸可阻止神经管畸形的发生，以及预防特定风险人群的癌症发生［12］、预防阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）及其它神经退行性疾病［13］等。最近的研究发现妊娠期母亲补充叶酸可以使30 月龄儿童表达语言得分提高［14］，而整个妊娠期补充叶酸对于改善早期运动反射发育和子代的空间学习和记忆能力将更有效［15］。Shona SI 的研究［16］也证实了叶酸对产前暴露于丙戊酸钠（valproate，VPA）的小脑神经毒性保护的作用。新事物识别实验是利用动物先天对新物体有探索倾向的原理建立，使动物在自由状态下进行学习记忆测试，相比与对照组母婴分离操作可使小鼠对新事物识别率显著降低，而叶酸可以使小鼠对新事物识别率提升，这与Lehmann［17］等研究结果一致。Macrt 和Laviola 研究［18］显示，早年经历母爱剥夺的小鼠，在青春期出现社交能力降低、性行为减少。我们的研究结果显示，在旷场实验和明暗箱实验中，模型组进入旷场中心次数及进入明箱时间比例显著低于对照组，而叶酸可以增加小鼠的水平活动能力，说明早年经历母婴分离小鼠成年后存在新奇环境中的紧张、焦虑水平增加和探索行为减少，而叶酸可以初步改善早期经历母爱剥夺所造成的在新环境中的紧张和焦虑状态。在十字高架迷宫，啮齿类动物面对新奇刺激与嗜暗天性时造成了探究与回避的冲突行为［19］，从我们的结果也可知母婴分离使小鼠进入开臂次数减少，产生焦虑；其中叶酸组呈现开臂活动增加的趋势，但与模型组比较结果未显示统计学差异，我们推测可能因小鼠个体差异较大。然而目前有关叶酸的研究主要集中在妊娠期，对出生后研究及对情绪研究较少。

Fig.4 Elevated plus maze test (EPM)

Fig.5 Percentage of novel object in novel object recognition (NOR)

Fig.6 Light and dark box test (LDB)

综上所述，啮齿类母爱剥夺影响其子代的行为，这提示生命早期不良环境持久影响身心健康［20］。但生命早期不良社会环境对精神健康的影响则可以通过人为干预逆转的，如药物、丰富环境［21］等，这与我们的研究结果一致，我们的初步的研究结果表明，叶酸可以改善早期不良环境对小鼠造成的焦虑行为和认知缺陷。由于我们的样本量偏小，母婴分离模型还在摸索阶段，并未涉及分子机制层面的研究，但有关其作用和机制我们正在进一步研究中。