大血藤总酚酸对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织氧化应激水平和能量代谢的影响

2019-12-26苗明三彭孟凡方晓艳贾佼佼

神经药理学报 2019年1期

苗明三彭孟凡方晓艳贾佼佼白明

河南中医药大学研究生院，郑州，450046，中国

脑血管疾病是危害中老年人健康的常见疾病之一，缺血区血流的再灌注可引起脑组织损伤及相关功能障碍更加严重，即脑缺血再灌注损伤［1］。脑缺血再灌注损伤过程中可引起一系列细胞、分子及其调节过程的变化，是导致中枢神经系统缺损的重要原因和全球死亡的第2 大常见原因。中医学具有整体观念的特点，中药具有作用于多靶点的特征，从而干预脑缺血损伤病理过程多条路径，防治脑缺血损伤，且毒副作用低，日益受到人们越来越多的关注。随着年龄的增大，老年患者身体机能逐渐衰退，五脏皆气虚，导致血液运行不畅甚至瘀阻。故中医认为，气虚、血瘀、热毒在脑缺血疾病的发生发展过程中占据主要因素。基于此，脑缺血适合采用活血化瘀药和清热解毒药治疗。

大血藤始载于《本草图经》，具有清热解毒、活血、祛风止痛之功效［2］。实验室前期研究表明，大血藤水煎液具有较好的抗脑缺血作用，大血藤的化学成分以酚酸类为主，酚酸类物质作为一类具有独特生理和药理活性的天然产物，具有较强的抗氧化作用，在抗肿瘤、防衰老和抗炎免疫等方面都具有良好的功效。但目前大血藤总酚酸对脑缺血再灌注的相关报道较少，近年研究表明，氧化应激与能量代谢障碍在脑缺血再灌注损伤的发生、发展中具有重要作用［3-4］。本实验主要观察大血藤总酚酸对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织氧化应激水平和能量代谢的影响，为其防治缺血性脑血管疾病的研究提供实验依据。

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

Wistar 大鼠，SPF 级，♂，98 只，实验动物合格证号：37005400 000023；实验动物伦理批号：DWLL 15010017，山东鲁抗医药股份有限公司提供。

1.1.2 药品与试剂

大血藤总酚酸，由河南中医药大学化学室提供，福林酚法测定含量为70.04%；尼莫地平片，批号140861，购自亚宝药业集团股份有限公司；脑络通胶囊，批号150401，购自吉林金宝药业股份有限公司；氯化苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC），批号04102711，购自中国华东师范大学化工厂（上海）；ATP 酶试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒，批号分别为20150826、20150821 和20150901，购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 实验仪器

线栓，产品号2838-A4，北京西浓生物技术有限公司；电子分析天平，型号FA2204B，上海精密科学仪器有限公司；台式低速自动平衡离心机，型号TDL-40B，长沙湘智离心机仪器有限公司；酶标仪，型号：BIORAD-680，美国BIO-RAD 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与给药

98 只大鼠正常饲养3 d，随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组（20 mg·kg-1）、脑络通组（500 mg·kg-1）以及大、中、小剂量大血藤总酚酸组（300、150、75 mg·kg-1），每组14 只，连续给予相应药物7 d，1 次·d-1。假手术组及模型组分别灌胃等体积溶剂。给药第6 d 晚上禁食，第7 d 早上给药1 h 后，麻醉，手术造模。

造模方法与参考文献［5-6］，基本操作为：用眼科剪于颈正中部开口，分离颈总动脉、颈外动脉并穿线备用。于颈总动脉距分叉5 mm 处剪开一小口，将线栓经颈总动脉分叉部插入颈内动脉，直至有阻力，2 h 后轻轻抽出栓线至略有阻力，实现再灌注，建立脑缺血-再灌注动物模型。假手术组仅暴露左侧血管，不做插线处理。

1.2.2 检测指标和检测方法

造模及给药结束后脱颈处死大鼠，剥取脑组织，放入-20℃低温冰箱中冷却15 min 后剔除小脑、嗅球和低位脑干后的剩余部分，沿冠状面切成2 部分。

第一部分为脑前极至视交叉冠状面前1 mm 处，矢状切取左侧脑组织（插线栓侧），并用生理盐水制成10%的脑匀浆，4℃、3 000 r·min-1离心10 min，取上清液分装，-20℃保存，待测ATP 酶活力，SOD、MDA 水平。

第二部分为视交叉冠状面前后1 mm 处，切成约2 mm 的薄片，置pH=7.2 磷酸盐缓冲液配制的1%TTC染液中，37℃水浴、避光条件下孵育10 min。取出，于10%福尔马林液中避光保存24 h。染色后未梗死的脑组织为玫瑰红色，梗死的脑组织为白色。经图像分析系统分析并计算梗死区面积，求其占总面积的百分比。

1.3 统计学处理方法

数据分析用SPSS 19.0 统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差（）表示，各组间比较采用单因素方差分析。

2 实验结果

2.1 大血藤总酚酸对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型脑梗死面积百分比的影响

由Tab.1 和Fig.1 可以看出，与假手术组比，模型组大鼠脑梗死面积百分比均显著升高（P＜0.01），说明造模成功；与模型组比，尼莫地平组、脑络通组、大血藤总酚酸大剂量组大鼠脑梗死面积百分比显著降低（P＜0.01）；中剂量组和小剂量组大鼠脑梗死面积百分比明显降低（P＜0.05）。大血藤总酚酸对脑梗死面积的改善作用呈剂量依赖性，且大剂量组的改善作用接近脑络通组，稍弱于尼莫地平组。

2.2 大血藤总酚酸对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型脑匀浆MDA 和SOD 水平的影响

由Tab.2 知：与假手术组相比较，模型组大鼠脑匀浆MDA 含量显著升高、SOD 含量显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，脑络通组、尼莫地平组、大血藤总酚酸大剂量组脑匀浆MDA 水平显著降低（P＜0.01），SOD水平显著升高（P＜0.01）；中剂量组脑匀浆MDA 水平明显降低（P＜0.05），SOD 水平显著升高（P＜0.01）；小剂量组脑匀浆MDA 水平明显降低（P＜0.05），SOD 水平明显升高（P＜0.05）。大血藤总酚酸对MDA 和SOD 的改善作用呈剂量依赖性，且大剂量组的改善作用接近脑络通组，稍弱于尼莫地平组。

Tab.1 Effects on cerebral infarction area percentage in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Fig.1 TTC staining of focal cerebral ischemia reperfusion model in rats

Tab.2 Effects of MDA and SOD levels in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

2.3 大血藤总酚酸对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型脑匀浆Na+-K+-ATP 酶活力和Mg2+-ATP 酶活力的影响

由Tab.3 知，与假手术组比，模型组大鼠脑组织Na+-K+-ATP 酶和Mg2+-ATP 酶活力均显著降低（P＜0.01）；与模型组比，尼莫地平组、脑络通组、大血藤总酚酸大剂量组大鼠脑匀浆Na+-K+-ATP 酶、Mg2+-ATP酶活力均显著升高（P＜0.01），中剂量组大鼠脑匀浆Na+-K+-ATP 酶活力明显升高（P＜0.05），Mg2+-ATP 酶活力显著升高（P＜0.01）；小剂量组大鼠脑匀浆Mg2+-ATP 酶活力明显升高（P＜0.05）。大血藤总酚酸对Na+-K+-ATP 酶和Mg2+-ATP 酶活力的改善作用呈剂量依赖性，且大剂量组的改善作用接近尼莫地平组，稍弱于脑络通组。

3 讨论

中医学认为气虚、血瘀、热毒是影响脑缺血发病的主要因素，活血化瘀药与补虚药在治疗脑缺血疾病中有着广泛的应用价值［7-8］。但是，清热解毒法的应用较少。随着对传统毒邪认识的深化，联系“中风热毒论”假说与“毒损脑络”的病机学说，从“毒”论治中风已成为中风疾病临床及机制的深入研究热点。本实验室通过总结文献报道，打破长期以来用“活血化瘀”为主的原则治疗本病，提出了运用“活血化瘀兼清热解毒”的中药防治脑缺血的观点［9］。

大血藤具有活血化瘀、清热解毒的功效。药理研究表明，大血藤对DPPH 具有较高的清除率、对黄嘌呤氧化酶活性具有抑制作用、对细胞内SOD 和总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）具有增强作用，表现出抗氧化活性［10-11］，且对心血管系统有较好的保护作用［12］，而其化学成分以酚酸类为主。本实验室前期研究表明，大血藤总酚酸可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织炎症反应、抑制脑细胞调亡，改善海马区和皮质区的病理性变化；同时，可降低脑缺血再灌注损伤大鼠的死亡率、降低神经功能缺失评分［13］，但并未进行其对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激水平和能量代谢的影响。脑络通胶囊具有补气活血，通经活络之功效，可扩张血管、增加脑血流量作用［14］；尼莫地平是脂溶性钙通道阻滞剂，是抗氧化应激类神经保护药物，对既往损伤区灌注不足部位灌注量的增加通常高于正常区域，具有保护神经元和抗脑血管收缩的双重作用［15］。因此，将脑络通与尼莫地平作为阳性药，以观察大血藤总酚酸对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑组织氧化应激水平和能量代谢的影响。

Tab.3 Effects of Na+-K+-ATP enzyme and Mg2+-ATP enzyme levels in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

目前，普遍认为氧化应激损伤、炎症反应、能量代谢障碍在脑缺血再灌注后引起的脑组织损伤过程中扮演重要角色。脑组织耗氧量高，最易受氧自由基的侵袭伤害［16］。SOD 是生物体内清除氧自由基最为重要的抗氧化酶，能有效地清除生物氧化产生的超氧阴离子自由基，并有终止自由基连锁反应的作用。MDA 是脂质过氧化最重要的产物之一，其积累过多可导致细胞结构与功能受损［17-18］。本实验研究发现，大血藤总酚酸各剂量组均能不同程度降低MDA 活性、升高SOD活性，表明大血藤总酚酸具有减少模型大鼠脑组织氧化应激水平的作用。脑组织对缺血、缺氧极度敏感，脑缺血早期即可出现脑细胞氧化磷酶化功能降低，ATP酶活力的高低可以反映细胞能量代谢水平。脑缺血时，由于线粒体功能障碍，ATP 生成减少，Na+-K+-ATP酶功能障碍，细胞内Na+增加，激活Na+-Ca2+交换体，Ca2+超载产生能量代谢障碍、加重脑组织损伤如此形成恶性循环，进而线粒体凋亡途径启动引起神经元死亡［19］。本实验研究发现，大血藤总酚酸各剂量组均能不同程度升高Na+-K+-ATP 和Mg2+-ATP 酶活性，表明其具有改善缺血再灌注模型大鼠脑组织能量代谢障碍的作用。

大血藤总酚酸可降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积、改善脑组织氧化应激反应和能量代谢障碍，效果呈现出剂量依赖性，且具有一定优势，及其缩小脑梗死及改善脑组织氧化应激的能力与脑络通接近，改善能量代谢的能力与尼莫地平接近，为大血藤总酚酸防治缺血性脑血管疾病的临床应用提供了依据。