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诱发慢性支气管炎动物模型方法及评价

2019-02-11张丹参

神经药理学报 2019年1期
关键词:烟熏烟雾支气管炎

李 炜 张丹参

1.河北北方学院药学系,张家口,075000,中国

2.河北科技大学,石家庄,050018,中国

慢性支气管炎(chronic bronchitis,CB)是指气管、支气管粘膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。临床上以长期咳痰或伴有喘息及反复发作为特征。慢性咳嗽、咳痰或伴有喘息,每年发作持续3 个月,连续2 年或以上,并能排除心、肺等其他疾患而反复发作,部分病例可发展成阻塞性肺气肿、慢性肺原性心脏病[1]。此病为常见病,人群患病率4%,多发于中老年人,50 岁以上可高达13%。慢性支气管炎发生的主要原因为病毒和细菌的重复感染形成了支气管的慢性非特异性炎症。当气温骤降、呼吸道小血管痉挛缺血、防御功能下降时易致病;烟雾粉尘、污染大气等慢性刺激亦可发病;吸烟使支气管痉挛、粘膜变异、纤毛运动降低、粘液分泌增多,易发感染。发病机制尚未完全阐明,炎症反应是其发生发展的核心机制,氧化应激、多种炎症因子和炎症介质的介导均起重要作用,粘液高分泌、气道表面脱水、气道重塑等则是炎症的继发表现[2]。目前,研究者已构建了多种慢性支气管炎的动物模型,较常见的是使用烟草烟雾、二氧化硫、内毒素(脂多糖)、蛋白酶和促分泌物的模型,也有用镍和硝酸引起的细支气管炎的报道[3]。用到的动物主要有大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠和狗,使用频率较低的还有绵羊、猴子、鳄鱼等。这些方法在动物气道粘液细胞的增生和转化的程度或位置、气道的充血程度、诱导时间和难易程度,以及可重复性等方面都存在差异。本文通过对这些慢性支气管炎动物模型的综述,为相关研究提供实验方法和思路,也可为环境污染物在暴露条件下如何,以及在何种暴露条件下可能加剧呼吸道充血、粘液高分泌等的相关研究提供参考。

1 烟熏法

该方法是将动物放入制作好的烟室内,通入烟雾,待一定时间后将动物取出,根据需要,重复不同次数和天数,以获得所需的支气管损伤模型。由于操作简便,支气管慢性炎症病变确切,成为最常用的方法,也是本次所查阅文献中提及最多的方法。该方法常用动物有大鼠[4]、小鼠[5]、地鼠[6]、豚鼠[7]等,还有学者用犬、猴、绵羊、雪貂[8]等进行研究的。例如:气管插管的犬暴露于香烟烟雾(12 支/天)长达一年,导致腺体增生、腺体黏液细胞增多、支气管上皮增生、支气管上皮细胞核异型性;每天4 或8 支烟,连续5 周的绵羊身上发现了气管腺肥大;每天12 支烟,每周5 天,最多6 个月的猴子,并没有显示出气管上皮细胞的变化[3]。

所查阅文献中,大家的方法不同之处主要是烟室的大小、制备烟雾的材料,以及烟熏的时间和频率,以获得支气管不同程度的损伤。以大鼠为例,首先,烟室的大小主要与动物只数有关,有研究者每个烟室放入一只动物[9];有的为了保证每组动物的干预条件一致,则将成组的10~12 只动物放入同一个烟室[10]。其次,制备烟雾的材料也有所不同,大部分为了模拟现实,多采用锯末、烟叶,也有的为了制造强烟雾,加入干辣椒、硫磺等[11],使烟雾更大更刺激。最重要的则是烟熏时间和频率的选择,通常每天暴露在烟雾中4 h,至少连续2~6 周,可诱发大鼠喉部及气管近端黏膜下腺体增生,气管黏液增多。增殖发生在近端和远端气道上皮,以及肺泡上皮。还可出现早期基底细胞的增殖,浆液性细胞表面发生黏液化生,黏液细胞和上皮细胞增生。在连续香烟烟熏6 周后,卫智权等研究者还观察到模型组大鼠其外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)(P65)表达水平显著升高,表明其体内PBMC 大量募集并激活,产生大量的超敏C 反应蛋白(hypersensive C-reactive protein,hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症细胞因子,导致细支气管慢性炎症损伤;与此同时PBMC 的核因子-κB 抑制因子-α(nuclear factor kappa B inhibitor-α,IκB-α)表达水平未发生相应幅度的有效上调,提示其体内PBMC 的κB(P65)激活未受到恰当的阻止而处于持续的激活状态,导致炎症持续而慢性化[12]。超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、SOD2、SOD3蛋白及其基因表达均显著降低(P<0.01),白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)、TNF-α、MDA 水平均显著升高(P<0.01)[13]。模型组大鼠外周血CD4+T 淋巴细胞比例明显升高,IL-2、IL-4 基因表达水平及蛋白表达水平显著上调(P<0.01)[14]。也有研究表明,戒烟后,气管内分泌细胞数量在9 d 内可恢复到正常水平,肺近端气道在10~21 d 内恢复到正常水平,肺远端气道在43~84 d 内恢复到正常水平[3]。Zheng 等[15]观察了大鼠20 d、50 d、70 d 持续接受烟熏,呼吸道和肠道菌群的同步动态变化。

经上述烟雾刺激后,Wistar 大鼠可出现咳嗽、哮鸣、呼吸困难、呼吸道分泌物增多,以及体瘦、毛枯易脱、蜷卧少动等改变。光镜下可见模型大鼠、小鼠的气管及支气管有不同程度的慢性炎细胞(淋巴细胞、浆细胞和单核细胞)浸润,以及少量中性粒细胞浸润。管壁大量纤维组织增生,明显增厚,管腔狭窄,腔内充满分泌物及渗出物,粘膜上皮细胞严重受损,呈现纤毛倒伏、粘连,脱落。杯状细胞增多,内含丰富的粘蛋白颗粒。伴行于气管的小血管周围有明显炎细胞浸润,管腔内有较多分泌物及巨噬细胞、多形核白细胞。肺泡隔增宽,有炎细胞浸润及毛细血管扩张、充血,肺边缘可见支气管扩张,甚至出现肺气肿。电镜见纤毛结构模糊,纤毛细胞内电子密度降低,核膜及细胞膜结构不清,有核固缩现象。线粒体肿胀空泡样变,内质网扩张,可见大量次级溶酶体,肺泡上皮受损。此方法比国内类似报道需时短,能促使病变早日形成,所出现的病理改变与人类相似,可用于研究被动吸烟所致的支气管炎症性疾病[5-16]。

1.1 大鼠强烟雾吸入法

锯末200 g,烟叶20 g,干辣椒6 g,硫磺1 g,混合后在27 m3(1 m×3 m×9 m)的烟室内点燃,形成浓烟雾,浓度约为200 mg·m-3,每天吸入1 h,共44 d[11]。

1.2 小鼠香烟烟雾刺激法

小鼠于10 L 卡口瓶中,瓶盖留有直径1.5 cm 通气孔,下口连接一个三通管,另两端分别连接50 mL 注射器及点燃的香烟,用注射器通过三通管,连续通入香烟烟雾,每次400 mL(瓶中烟雾浓度约为4%)烟熏30 min。前10 d 上下午各烟熏一次,后10 d 每天下午烟熏一次,连续30 次,全程约20 d[5]。

1.3 地鼠香烟烟雾吸入法

采用2 月龄雄性叙利亚金黄地鼠(100~120 g)。吸烟组动物放入自制的吸烟箱中,每次燃烧10 支香烟(八达岭牌,北京卷烟厂)共3 h,每天燃烧2 次,每周5 天,连续3 个月[6]。

1.4 豚鼠香烟烟雾吸入法

采用哈特利豚鼠(300~350 g),雌雄兼用,使用市面上出售的过滤嘴卷烟(Cocopalm 牌卷烟),根据产品规格,每支香烟含有1.2 mg 尼古丁和13 mg 焦油。动物被放置在一个不锈钢烟室(80 cm×80 cm×100 cm),意识清醒且不受约束。豚鼠被反复暴露在每天10 支香烟的烟雾中,每天1 h,连续6 d 每周,持续8 周[7]。

2 吸入二氧化硫法

该方法常选用大鼠、小鼠、豚鼠、犬或猴,吸入刺激性气体(如二氧化硫,氯气、氨气等)[3],也可利用亚硫酸钠与过量的硫酸反应生成SO2[17],或与细菌感染、复合性刺激(如细菌加烟雾、二氧化硫加颗粒),数日后即可出现慢性支气管炎病变。

小鼠、大鼠及豚鼠吸入二氧化硫法造成慢性支气管炎病变中,以杯状细胞增多、柱状上皮增生及慢性炎症细胞浸润最为常见。尽管这些病变程度可能不一致,但它们的综合出现,特别是在支气管及末梢细支气管见到这些改变,就可以作为慢性支气管炎的形态学诊断指标。SO2暴露对体外测定的气管收缩反应无影响,暴露于SO2的动物的气管和肺的中性黏液糖蛋白分别增加了140%和535%,酸性糖蛋白分别增加了33%和37%,这种慢性支气管炎的动物模型模拟了在人类支气管炎中观察到的粘液分泌过多、气道阻塞和气道反应性增强[18]。上述造模方法,大多需要较长时间,在实验过程中,应考虑到动物支气管管壁的淋巴组织可能有不同程度的增生,以免影响实验结果的正确分析,选择动物时,也应充分考虑这一因素,选择年龄稍轻、健康状况良好的动物造模为佳[19]。

2.1 小鼠二氧化硫吸入法

有两种造模方法:①吸入二氧化硫2%,每天10 s,60 d,第14~18 d 出现支气管病变,27 d 后出现重型气管炎病变[20]。②吸入二氧化硫1%,每天20 s,25 d,d 20 出现慢性支气管炎病变[21]。

2.2 大鼠二氧化硫吸入法

二氧化硫2.3 mL·L-1空气,每天30 min,d 56 出现慢性支气管炎病变;吸入二氧化硫3 mL·L-1空气,每日5 min,每周6 次,45~51 d,d 36~45 出现慢性支气管痉挛。大鼠暴露于250 ppm SO2气体中,每天5 h,每周5 d,持续4 周[22]。

2.3 猴二氧化硫吸入法

吸入SO20.5~0.8 mL·L-1空气,每日2 h,每周5次,65 d,在50 d 时腺体显著增生,出现慢性支气管炎病变[23]。

3 内毒素注入法

该方法常使用的动物有大鼠、小鼠,可采用气管滴注内毒素,即脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)的方法建立慢性支气管炎模型,也可经气道吸入,如气管内注入LPS 200 μg·200 μL-1及每日LPS 溶液雾化吸入1 h,连续3 周,建立大鼠慢性支气管炎动物模型[24]。

LPS 是革兰氏阴性细菌细胞壁的最外层结构,系类脂质、多糖及蛋白质的复合物。它可以刺激单核细胞、内皮细胞及中性粒细胞合成释放一系列炎性介质,介导多种组织、细胞的损伤。对大鼠气管滴注小剂量的LPS,可以刺激大鼠肺部中性粒细胞的游出,增加的中性粒细胞可通过释放蛋白水解酶、氧自由基、一氧化氮(nitric oxide,NO)及其他细胞因子造成支气管肺组织损伤,从而模拟慢性支气管炎的病理特征。LPS 还可通过与肺泡巨噬细胞膜上的CD11c/CD18c 和CD14 两种受体结合,导致胞浆游离钙离子浓度升高,进而影响TNFα、IL-1、IL-10、TGF-β1 等细胞因子的合成和分泌,从而引起慢性支气管局部的炎症反应。该方法操作简练、污染少、易定量。

3.1 单独使用LPS

曹强等[25]使用SPF 级雄性SD 大鼠,体重300~350 g,将LPS 200 μg 气管滴注入气管内,饲养3 周。3 周后,可观察到模型组的大鼠进食显著减少,体重增长明显缓慢,并出现了倦怠、竖毛、毛发失去光泽等现象。左肺做病理学显微镜检查,病理切片上可见,气管、支气管纤毛柱状上皮部分剥落,粘膜层和粘膜下层有炎性细胞浸润,腺体增生,分泌旺盛,杯状细胞显著增生,以及肺气肿的形成。同时可以观察到气管上皮细胞有鳞状化生的现象。取大鼠右肺灌洗液,对细胞分类计数,每张涂片计数200 个细胞,分别计数肺巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞,模型组均有显著性差异(P<0.01),中性粒细胞的数量明显增高,而巨噬细胞的数量显著降低,导致大鼠的肺部防御功能降低。邓青南等[26]改进实验方法,将24 只Wistar 大鼠用2%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,仰卧位固定于操作台,常规消毒,纵向切开颈部,分离皮下,暴露气管,4 号针头穿刺气管,给予气管内一次性注入脂多糖200 μg,d 2 开始,连续4 d 经鼻滴入脂多糖50 μg·200 μL-1·d-1。3 周后处死大鼠后观察病理变化。改进后双通道脂多糖造模,大鼠肺气道上皮炎性细胞浸润、纤毛粘连脱落、杯状细胞增生、气道黏液分泌等增加更加明显,除杯状细胞增生,其余指标的增加均具有统计学意义。改进后造模方法所致慢支模型在未出现急性肺损伤的情况下,气道慢性炎症程度更明显,气道黏液分泌更加明显,这样更有利于研究慢支痰量过多的实验研究的开展。

3.2 注入LPS 联合烟熏法

王瑛等[27]用雄性二级Wistar 大鼠18 只,鼠龄8 周,体质量(180±20)g,分别于1、8、15、22 d,向大鼠气管内缓慢注入LPS 200 μL(脂多糖10 mg 每瓶,购自美国Sigma 公司,用无菌注射用水制成水溶液,1 mg·mL-1),以防窒息。完毕后迅速将大鼠直立旋转10~20 s,使LPS均匀分布于肺部。3~8 d、10~15 d、17~22 d、23~28 d,每天在有机玻璃熏烟箱内持续吸入新鲜的哈德门香烟雾30 min,15 支每次,2 次每天。

3.3 注入LPS 联合注射卡介苗法[28-30]

给大鼠尾静脉注射5 mg·kg-1的卡介苗,7 d 后向大鼠气管内注射1 mg·mL-1的脂多糖,每只注射200 μL,观察3 周。结果模型组的大鼠出现倦怠、活力下降、毛发灰白等症状,体重的增加明显低于正常组(P<0.01),且在气道内粘液增多,喘息症状明显。镜下,气道炎症细胞增多,气管、肺泡壁充血,纤毛柱状上皮脱落,可见部分胼胝体细胞。支气管平滑肌部分断裂。采用Ridit 试验分析炎症细胞浸润量,模型组炎症细胞浸润量最高。电镜观察,模型组大鼠支气管纤毛数量减少,变短或倒伏,炎性细胞浸润增多。Ⅱ型肺泡细胞肿胀和退化。肺泡细胞线粒体肿胀,肺泡壁断裂。支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及中性粒细胞、肺泡巨噬细胞比例均显著升高(P<0.05),肺泡巨噬细胞中NO含量及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性显著升高(P<0.05)。模型组的前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)活性比正常组明显增强,环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX2)mRNA 表达明显增加,COX-2 蛋白表达明显高于正常组。

3.4 注入LPS 联合被动吸烟及SO2吸入法

杜秀婷等[31]将小鼠于实验d 1、d 14 分别经气管和经鼻腔注入LPS,同时,于d 2~30(d 14 除外)进行被动吸烟及SO2吸入;SO2组小鼠每天熏SO22 min;烟熏组小鼠每天吸烟4 支每次,直至1 包烟燃烧完毕,共约1 h;脂多糖组小鼠在造模d 1 气管注入LPS,d 14、d 30 进行LPS 滴鼻。各模型组均连续造模30 d。结果与烟熏组、二氧化硫组比较,慢支改良组肺泡灌洗液白细胞总数显著增高(P<0.01);慢支改良组与其它3 组比较肺组织炎症细胞浸润程度显著升高(P<0.01)。

4 复合因素造模法

蒋明等[32]综合上述方法,通过给予Wistar 大鼠烟熏(每次5 支,30 min 每次,连续6 周)、脂多糖(d 1、d 14 气道内注入LPS 200 μg)和18%低氧(从第5 周开始,舱内烟熏同时叠加每天吸入18%低氧8 h,每周6 d)复制慢支、肺气肿并肺动脉高压动物模型,气道、肺组织改变符合人类慢支、肺气肿病理改变特点。该组动物肺血流动力学异常改变,mPAP、RVSP 和RV/LV+S 增高,肺血管分析提示肺动脉重构,肌化型动脉比率增高、管壁增厚,模型体现了动脉高压和相关肺血管重构;气道纤毛倒伏粘连,上皮细胞鳞状化生、黏液杯状细胞显著增生,黏膜水肿;管腔内中性粒细胞增多,气道壁以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润明显,局部还可见明显的淋巴滤泡形成;管壁平滑肌束增生,部分区域因炎症细胞浸润出现平滑肌束断裂;肺气肿明显并可见肺大疱形成。

总之,由于动物和人类的气道存在解剖学差异,上述常见的造模方法并不能完全模拟人类慢性支气管炎的全部病理改变,比如啮齿动物和兔子在肺内气道中缺乏粘膜下腺体,使用这些物种的模型不能期望显示出支气管腺肥大。小鼠的支气管炎模型并没有表现出慢性支气管炎时慢性充血的单核细胞特征,以及T 细胞气道壁浸润和间充质重塑。这些方面的特征灵长类动物、狗和雪貂或许更适合。另外,目前支气管炎的动物模型中没有一种含有病毒或细菌制剂来加重支气管炎。由于感染因素在人类慢性支气管炎加重中很重要,这也需要开发新的慢性支气管炎气道感染动物模型[3]。

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