动物认知行为学在AD模型中药效评价的应用

程宇

[摘要]动物行为是受中枢神经系统控制的，因此能很好地反映动物脑部的结构功能。阿尔茨海默病（AlzheimersDisesse）是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆症最常见，也是最平常的一种类型。临床主要表现为记忆性障碍、认知性功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，日常生活能力会有减退，并有神经精神症状和行为障碍严重影响社交、职业与生活功能。因此，通过八臂迷宫、旷场等动物认知行为学实验能很好地反映AD研究药物对AD模型动物认知和记忆功能的影响，从而了解AD研究药物的治疗效果。

[关键词]AD；八臂迷宫；旷场；物体识别

随着人口的老龄化，认知障碍疾病如阿尔兹海默病己成为危害社会人群健康的重大疾病之一。流行病学研究显示，AD的患病率随年龄增高而增高，在65岁以上人群中约为5%，而在85岁以上人群中约为20%。我国目前患有AD的患者大约350～450万，通过大样本流行病学的相关性调查发现我国55岁以上AD的患病率分别为2.59%，65岁以上为4.8%。尽管AD发病的具体诱发机制仍不十分明确，但可以知道B淀粉样蛋白及Tau蛋白异常修饰等在病理过程中起到关键作用，被广泛公认。但是由于国际上对AD病理靶点的研究还不够深入，目前尚缺乏有效的指导思想和治疗药物，因此，寻找更准确有效的指导思想，治疗靶点和相关药物，成为AD治疗研究重中之重。

在利用动物样品（小白鼠）来进行实验的阿尔茨海默病的病理病例研究中，主要侧重反映各种记忆能力，例如空间记忆能力的结论测试，测试方法有八臂通道迷宫实验，新物体辨别实验等，目前关于阿尔茨海默病的动物模型实验活动相关研究还比较少，所以我们现在通过旷场实验对AD动物模型的自主行为特点进行了分析。

1实验部分

1.1实验动物

啮齿类动物具有价格低廉、侍养简单、生存率高等特点，并且其与人类的脑部解剖结构和生理特征较为相近和相似，更适于诱导模型测试的大量使用，成为AD最常用的动物测试模型。因此实验室一般选用实验鼠等啮齿类动物。雄性SD大鼠44只，购买于广东省实验动物中心，实验所需体重严格控制在250～300g范围内。

1.2八臂迷宫

1.2.1实验原理

八臂迷宫实验，是目前国内外最为常用，最具有参考价值的评价动物学习记忆能力的模型，是由Olton等人建立。主要作用于检测临床药物在实验动物体内，主要是大脑受损状态下，工作记忆行为和参考记忆行为等方面的表现，它是由若干个完全一样的臂组成的，这些臂从中央向四周围放射出来，每个臂尽头有水和食物提供，实验人员再根据分析动物取食的策略等各种不同参数可以反映出样品动物的对应记忆能力。迷宫操作简单、可行，现已被广泛用于学习记忆认知实验功能评价。

1.2.2实验步骤

（1）实验动物来到应首先适应新环境，适应新环境7-10天后，定期为其称量体重，禁止进食1-2天，每次训练完结后限制性地提供食料约（15-20g），以使实验动物的体重一直保持在正常进食对照鼠的80%-85%的范围。（2）第二天，工作人员在迷宫的每个臂端及中央区开始分撒食物颗粒（每只5～6粒）。同时将对应数量的实验动物置于迷宫中央（打开通道门）。让实验老鼠自由摄食、探究10min。（3）第三天，重复第二天的训练。目的是为了让实验动物在没有应激条件下反复熟悉环境。（4）第四天起，对实验动物进行单个训练：在每个臂靠近外端食盒处各放一颗食粒，让动物自由摄食，并记录数据，食粒吃完或10min后将动物取出。（5）第五天，将食物放在食盒内，将实验鼠进行重复训练，一天2次。（6）第六天以后，随机选若干个（建议先取4个）臂，每个臂放一颗食粒；各臂门关闭，将实验动物放在迷宫中；30s后，臂门打开，让动物在迷宫中自由活动并自行摄取食粒，直到动物吃完所有4个臂的食物。若果10min后，食粒仍未吃完，则实验终止。

每天需要来回进行两次训练，每次其间间隔约1h以上。白鼠进入有食物的臂且摄取了食品为一次正确选择，反之则为错误选择。连续训练5次，错误选择次数为1次或1次以下，同时WME必须为零的情况下，断定训练成功。

1.2.3注意事项

本次试验在操作的过程中主要注意事项是禁止进食，保持重量为原体重81.00%-86.00%，从实验的结果和相关数据显示：实验组与对照组的动物无明显差异性，排除因样品饥饿程度不同与其他非学习因素对实验结果造成的影响。迷宫实验外的一切物品在实验过程中均始终保持不变，目的是使动物进行对照。

实验显示，样品大鼠在八臂迷宫内，对于周围光照、人或移动物体以及迷宫内有食物残渣及粪便的情况不了解等因素导致害怕，肾上腺素分泌过多对实验结果有很大的影响，因此实验环境始终需要保持安静，排除外界因素干扰。以上措施，保证了本次采用八臂迷宫训练小鼠实验的确实可信性。

1.3旷场实验

1.3.1实验原理

旷场实验原理是评价在新环境中实验动物的自主行为、探究行为与紧张程度的一种测试方法。以实验动物（白鼠）在新环境中的某些特殊行为的持续时间，出现频率和出现次数等，反映实验动物在新环境中的研究行为，主要观察实验动物尿便次数的反应及其紧张程度。

1.3.2实验过程

实验过程，关键要求必须是日常参与实验的实验人员搬运大鼠，实验员与设备保持适当距离，实验员避免被实验大鼠看到。将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察3～5min。取出大鼠后，用纸巾沾取75%乙醇彻底清除迷宫，等待液体挥发扩散后，再进行下一只大鼠的测试。避免前一实验结束后實验动物的残留痕迹影响下一实验的测试结果。然后更换实验动物再继续该实验。

根据计算机软件设计不同可观察的参数不同，如某一肢体越过的格子数为水平得分，后肢站立次数为垂直得分，修饰次数，尿便次数；运动速度，沿边运动距离，中央运动距离等。所用的计算机失踪分析系统与新物体识别相同，旷场底部被分成面积相等的9块正方形格子。将实验鼠放置在中央格，旷场上方的摄像机开启并记录该动物在一段时间内的活动情况，通过软件分析系统分析实验鼠在一定时间内的活动状态，约10min。

主要观察目标：①其在方格间穿行的次数②直立次数③实验鼠在中央格停留时间④实验鼠穿过中央格次数等。

研究认为，实验鼠经过格子的次数可代表动物的兴奋程度；实验鼠站立的次数可以代表动物对陌生环境的好奇心及适应能力。数据采用均数±标准差表示，P<0.05，被认为是有统计学相对差异。

一般情况下，实验鼠喜暗，因此其在旷场实验中经常在边缘区域活动，但对照鼠没有目标地在旷场中奔跑，由于其在中央区出现的次数明显多于正常大鼠，直立次数、活动总数以及在中央区出现的比率等几项指标反映大鼠的自主活动，并和AD大鼠病情严重程度有相关性。因此在一定程度上可以反映相对人类患者也会表现出烦躁不安，肢体强直等次能够为发病特征。实验证明，旷场实验能够检测动物模型的自主行为变化，可以用做更广泛的药物研发实验。尤其是随着现代教育技术发达，再加上计算机技术和图像处理技术摄影技术等的引入，使动物行为分析的检测指标和工具大大增加，显现出该实验的高效、无创、灵敏、客观等优点。

2总结

目前，世界各国包括我国，随着人口老龄化进程的到来，和年龄相关的认知性功能障碍已经成为目前医药行业神经科学研究的热门话题。为了能使人们更好地了解认知性功能相关疾病的发病机理，选择合适的方法很重要，例如动物行为学实验研究方法（如旷场实验）对于目前的行业来说是有必要的。各种动物模型的出现，使得认知功能评估可以为研究AD提供重要的依据。其局限性为，人类和实验动物存在种群差异和个体差异，人类的认知功能区别于动物，是一个高级复杂的脑部神经活动过程，而动物的行为学实验内容也有别于人类的认知，人类的许多认知功能是人类独有的而不能在实验模型中表现出来的。在实验过程中，因个体以及种群差异，仅仅通过动物的表现而不参考人类的实际表现是无法精确评估学习和记忆的完整信息的，因为实验动物可能受认知能力等不相关的因素干扰。而每种行为学实验方法的使用条件与侧重点都不一样，应用时要根据不同样品的不同需要进行适当选择。必要时也可结合多种动物行为学实验方法来进行不定期综合统计分析，与影像学、现代教育学，组织病理学，组织药理学及神经电生理技术等结合，为阿尔兹海默病的研究提供科学可靠的依据。