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N-甲基-D-天冬氨酸受体在记忆网络中的作用

2019-12-26张丹参苏晓梅

神经药理学报 2019年1期
关键词:兴奋性亚基腺苷

张丹参 苏晓梅

1.河北科技大学,化学与制药工程学院,石家庄,050000,中国

2.河北医科大学,基础医学院,石家庄,050000,中国

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质之一,参与认知、学习记忆和神经退行性疾病等多种生理病理过程,谷氨酸受体可分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体,而N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)作为离子型谷氨酸受体家族中的重要一员,是神经系统发育以及神经毒性的核心。作为突触可塑性的关键,NMDA受体的阻断会干扰记忆的形成和记忆的恢复。NMDA受体在中枢系统中广泛参与学习记忆、突触可塑性、缺血性脑损伤及情绪障碍、癫痫等许多生理病理过程。本文以NMDA 受体在学习记忆网络中的关联为切入点,评价NMDA 受体在学习记忆网络中的作用,以期为未来脑功能及相关疾病系统的研究开辟新思路。

1 NMDA 受体

1.1 NMDAR 家族

在中枢神经系统中,氨基酸是常见的神经递质。根据其在神经传递中的作用,可分为两类:兴奋性氨基酸,以谷氨酸(glutamate,Glu)作用最明显;抑制性氨基酸,以甘氨酸(glycine,Gly)为代表。氨基酸受体也分为兴奋性氨基酸受体和抑制性氨基酸受体。兴奋性氨基酸受体中,研究得较为深入的当属Glu 受体,依其分子结构、作用机制和所介导的最终效应不同,Glu 受体分为离子型受体(ionotropic glutamate receptor,iGluR)和代谢型受体(metabotropic glutamate receptor,mGluR)两类。iGluR 与离子通道藕联,而mGluR 则与G 蛋白藕联。iGluR 可分为三个亚型:NMDA 受体,海人藻酸(kainic acid,KA)受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-丙酸异噁唑(α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazolepropionate,AMPA)受体[1-2]。AMPA 受体最初被称为使君子氨酸(quisqualate,QA)受体,后因发现QA 可与mGluR 相互作用,且对AMPA 的作用更为特异,故现称AMPA 受体。但是无论药理学研究还是受体氨基酸组成和序列分析,都表明NMDAR 与其他两种离子型受体有很大区别,故目前又有NMDAR 和非NMDAR(non-NMDAR)之分,后者包括KA 受体和AMPA 受体[2]。

NMDA 是1962 年 由Watkins[3]首先合成,其化学结构与Glu 类似。NMDA 外观为白色,分子式为C5H9NO4,相对分子质量为147,微溶于水,其化学稳定性良好,但吸湿性强,易潮解。NMDAR 分布于整个脑区,前脑较为集中,而以海马CA1 区的含量最高[2]。NMDAR 高密度区包括额皮叶、前扣带皮层、梨状皮层、顶皮层,基底神经节,背外侧隔区,杏仁核,海马CA1区放射层和多形细胞层;NMDAR 中等密度区为海马CA3 区的绝大部分和齿状回。

1.2 NMDAR 的亚基

NMDAR 是由不同亚基构成的异四聚体[4],具有三种不同类型的亚基:NR1、NR2、NR3,不同的亚基在学习记忆中均发挥重要作用。

NR1 亚基具有配体结合活性,是NMDAR 的基本功能亚基。NR1 基因定位于9q34.3,编码一条含920个氨基酸的单链,完整的有功能的NMDAR 必须要由NR1 亚基组成[5],因此NR1 亚基具备NMDAR 复合物的所有特点[6]。NR1 亚基在整个大脑,几乎所有的神经元和部分神经胶质中都有表达。由于NR1 亚基是NMDAR 的必备亚基,故NR1 表达水平可反映NMDAR 数量,其表达水平的改变是调控突触可塑性、参与学习记忆功能的重要机制[7]。NR1 亚基是使NMDAR 具有细胞膜受体功能的必需成分[8],NR1 亚基的缺失,将严重影响NMDAR 的功能。研究表明,空间学习能力强的大鼠海马NR1 亚基蛋白的含量比空间学习能力弱的大鼠高45.4%[9]。Shimizu 等[10]发现,NR1 基因剔除小鼠其海马CA1 区NMDA 兴奋性突触后电位消失,长时程增强(long-term potentiation,LTP)诱导产生障碍,逃跑潜伏期明显延长,说明NR1 基因剔除小鼠由短时记忆到长时记忆的巩固过程受阻。因此认为NR1 亚基与学习记忆关系密切,是学习记忆形成过程中必不可少的NMDAR 亚基。

NR2 分为NR2A、NR2B、NR2C、NR2D 四种亚基,其蛋白质分别由1 445、1 456、1 220(或1 218)、1 296个氨基酸组成,分子量分别为163 kd、163 kd、134 kd、141 kd[11]。NR2 本身没有配体结合活性,但能够影响NMDAR 的特性,是NMDAR 的调节亚基,并通过不同类型亚基与NR1 的组合使NMDAR 表现为功能上的多样性,对整个受体通道的功能起修饰作用[12]。NR2亚基在很大程度上决定NMDAR 激动剂亲和力、Ca2+渗透性、Mg2+敏感度和单通道电导等生理功能[13]。完整的功能性NMDAR 至少含有1 个NR2 亚基,NR2 的参与可赋予通道复合物以不同的电生理学和药理学特性。NR2A 和NR2B 在大脑皮层和海马区都有表达,主要在神经元中表达。NR2C 在中脑和小脑的大部分区域表达[14],NR2D 在胚胎学中表达,贯穿脑干和中脑结构,并在某些细胞类型中一直表达至成人时期[15]。在哺乳动物中,调节亚基主要为NR2A 和NR2B[16],NR2A在胚胎时期几乎无法检测到,但NR2B 的表达量很高,在出生后的最初几周,NR2A 表达量的增加而NR2B 略有下降[17]。在衰老大鼠中,NR2B 表达大幅下降且伴随记忆缺陷[18]。实验表明,个体发育早期NR2B 居多,分布在全脑各处,NR2A 则仅局限于海马等区域[19]。随着发育过程,NR2A 的含量逐渐增加且分布范围扩大,出现在端脑、丘脑、海马和小脑中,NR2B 则仅在杏仁体、海马等可塑性的脑区终生表达[20]。NR2A 和NR2B 二者表达比例的改变是不同状态时突触可塑性差异的重要原因之一[21]。研究表明,NR2A 的C-末端敲除后小鼠可以存活,但出现突触可塑性和学习记忆障碍[22],若敲除小鼠的完整NR2A 基因,则其空间记忆受损[23];此外,NR2B 过表达小鼠则表现为学习记忆力增强[24],但敲除前脑或海马NR2B 亚基将破坏小鼠空间和非空间表现型,诱发选择性、短时程的空间工作记忆缺陷[25],由此可以证明无论NR2A 还是NR2B 都是参与学习记忆产生过程中必不可少的亚基。

NR3也是NMDAR的调节亚基,包含NR3A 和NR3B 亚基,NR3 的参与决定了通道药理和生物物理特性[26]。NR3A 主要分布于海马、皮质和丘脑等部位,NR3B 主要分布于运动神经元[27]。NR3 可以提供Gly结合位点[28],使Ca2+通透性、Mg2+敏感性及受体通道开放率降低,且可以对通道的构成进行抑制性调节,对NMDAR 电流起负调控的作用。此外,由于NR3 能够降低电流幅度及Ca2+通透性,提示其可以通过降低Ca2+超载引起的神经毒性,而具有一定的神经保护作用[29]。据相关文献可知,NR3A 可以促进树棘突、可塑性及突触形成,一旦敲除该亚基后,NMDAR 过量出现,引起细胞凋亡、组织坏死,造成学习记忆障碍[30],表明NR3 同样是学习记忆产生过程中必不可少的亚基。

1.3 NMDAR 的结构

2014 年,Lee CH 等[31]报道了非洲爪蟾NMDAR的X 射线晶体结构,表明NMDA 受体的亚基以1-2-1-2的方式排列,使得氨基末端和配体结合域之间具有广泛的相互作用,其跨膜结构域包含一个封闭的离子通道,一个排列着与结合离子通道阻滞剂和镁有关的残基的金字塔状的中央前庭,以及双重对称排列的离子通道孔,该研究为NMDA 受体的结构和离子通道功能提供了新的认识。

功能性的NMDAR 是一个四聚体离子通道,通常由两个NR1 必备亚基和两个NR2 调节亚基组成[32],NR1 亚基通过与NR2 亚基结合,才能形成高度活性功 能 的NMDA 通 道[33-34],其 中NR1-NR2A-NR2B 复合物是海马突触上主要的NMDA 受体[35],具有独特的药理学、动力学和门控特性。NMDAR 的结构类似于Hebbian 的检测器,需要Gly 和Glu 分别与NR1 和NR2 亚基结合[36],再结合膜的去极化作用减少镁阻滞[37]。激活受体,打开阳离子选择性的Ca2+渗透通道,细胞膜进一步去极化使Ca2+流入[38],大量的Ca2+内流入突触后神经元引起一系列的生化反应,使突触发生改变[39],对学习记忆产生一定的影响[40]。由于NMDAR 为非选择性的阳离子通道,细胞外的Mg2+可以阻断Ca2+外流,从而对外界电压产生敏感性[41]。若NR1 亚基与NR3 亚基形成二聚体,则使Mg2+的敏感性增强,NMDAR 的单通道电导和Ca2+渗透性降低,使NMDAR 的活性受到抑制,可以降低由于过度活化引起的兴奋性神经毒性[42]。

NMDAR 亚基在氨基酸序列上是相关的,像AMPA和KA 受体亚单位一样,在膜的细胞外侧具有氨基末端结构域(amino-terminal domains,ATDs)和配体结合结构域(ligand-binding domains,LBDs),跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)限定离子通道孔以及细胞质内的羧基末端结构域(carboxy terminal domain,CTD)[43]。从NMDA、AMPA 和KA 受体分离的LBDs的高分辨率晶体结构表明,这些结构域具有相似的蛤壳状结构,以近似二聚体的背靠背方式组织起来[44]。虽然分离的ATDs 晶体结构也具有蛤壳样结构[45],但NMDA 受体中各蛤壳叶的结构不仅不同于AMPA 和KA 受体,而且亚基之间的相互作用也不同[46]。NMDA离子通道孔是镁和小分子阻滞剂的结合位点,其功能特性也不同于AMPA 和KA 受体。

2 NMDAR 的作用位点及调节因素

NMDAR 通道大分子上存在着许多独立的结合位点(Fig.1):①Glu 作用位点;②Gly 作用位点;③Mg2+作用位点;④Zn2+作用位点;⑤多胺作用位点。除了与上述位点直接结合激活或阻断NMDAR,还可以通过其他因素,作用于NMDAR 通道,调节中枢神经元的兴奋性,包括:pH 调节因素、氧化还原调节因素、突触后致密物调节因素等。其中,Gly 是Glu 为开放受体通道所必需的,多胺对通道开放起正性调节作用,而Zn2+、Mg2+则起负性调节作用[2]。此外,这些位点之间还存在着复杂的交互作用[47],NMDAR 通道是由复杂多样的因子所调节的。

2.1 Glu 作用位点

Glu 在大脑发育和整个生命过程中均发挥重要作用。此外,大脑发育早期突触的形成、维持和可塑性过程都受Glu 系统的影响。不同的Glu 受体激活兴奋性神经元和胶质细胞,在神经通路和细胞水平上发挥作用[48-49]。膜片钳技术证实Glu 的促智作用是通过NMDAR 实现的,在电极内液中不含Glu 时NMDA 受体通道罕见开放,电极内液中含有Glu 时NMDA 受体通道活性增加,通道开放时间延长、开放频率增加,并且这种增大具有浓度依赖性[50]。Glu 作为NMDAR 经典的激动剂,高浓度Glu 的作用于NMDAR 识别部位,使细胞膜去极化,离子通道开放。低浓度的Glu 则不能使NMDA 门控的离子通道打开,需要Gly 的参与。脑内注射Glu 受体激动剂同样有促进记忆的作用。如吡拉西坦(piracetam,脑复康)与Glu 受体有较高的亲和力,可在NMDAR 的Gly 调节部位增强Glu 及NMDA 的效应,并提高老年小鼠脑内NMDA 受体密度,其促进记忆作用可被NMDAR 拮抗剂氯胺酮(ketamine)拮抗[51]。

Fig.1 Schematic diagram of NMDA receptor site of action

2.2 Gly 作用位点

Gly 受体和NMDR 有相同的分布,并对NMDA受体激活有增强作用[52]。Gly 能增加Glu 与NMDA识别位点的亲和力,使通道开放频率增加4~6 倍[53]。研究表明NMDAR 被Glu 激活前,需要Gly 的结合,Gly 起着NMDAR 协同激动剂的作用。若溶液中没有Gly,则在爪蟾卵母细胞中注入从大鼠脑提纯的NMDA 受体mRNA,也不能检测到NMDA 反应;但是若换用脑片培养,由于有内源性Gly,则可观察到此类反应。如果加入竞争性占领Gly 结合部位的7-氯犬尿酸(7-chlorokynunenic acid,7ClKyn),则可完全阻断NMDA 反应。放射配基结合实验表明,Gly 和Glu 皆可增强对方与受体的亲和力,表明在NMDAR 上两者都有各自的结合部位[2]。

2.3 Mg2+作用位点

Mg2+是兴奋性氨基酸受体NMDA 非竞争性阻断剂和Ca2+拮抗剂,可以抑制核酸内切酶的活性,阻断核内DNA 降解和细胞凋亡[54]。NMDAR 通道的开放受配体和膜电位的双重控制。在约-70 mV 的静息态的膜蛋白条件下,Mg2+等镶嵌在通道深部,阻挡胞内外离子交换,这时即使Glu 和Gly 结合到NMDAR,Mg2+也会阻断离子的流出。细胞去极化时Mg2+被电场力移开,离子得以流动,Mg2+的抑制作用逐渐减小并消失。即使在-50 mV 的很轻微的细胞膜去极化条件下,Mg2+的阻断作用也会被减轻[55],说明Mg2+是调节NMDAR的重要位点。需要注意的是,在Mg2+浓度很低的情况下,存在不依赖于Mg2+的阻断机制,这可能是由于通道构象的改变引起的[56]。提高Mg2+浓度能够增加NR2B 的表达量,增加其下游的信号通路,而NR2B 的增加能够增强NMDAR 依赖的LTP,学习记忆能力自然也就得到了提高[57]。

2.4 Zn2+作用位点

Zn2+储存于中枢兴奋性末梢的突触囊泡内,是NMDAR 与其激动剂结合的抑制剂,可以显著降低Glu 的结合。在皮层海马神经元,低浓度Zn2+能阻断NMDAR 介导的反应,其抑制作用不呈电压依赖性。剂量依赖效应曲线的分析表明,Zn2+可以非竞争性地拮抗NMDAR 的反应。升高Gly 的浓度不能翻转Zn2+的抑制作用,表明Zn2+有单独的结合位点。此外,Zn2+不能像Mg2+一样对NMDAR 的反应呈电压依赖性抑制,表明Zn2+不与Mg2+在离子通道内竞争结合[58]。研究表明,Zn2+对NMDAR 的抑制作用需要两个结合位点参与,其一是高亲和力、非电压依赖性结合位点,其二是低亲和力呈电压依赖性的结合位点[59]。此外,缺Zn2+会显使得脑中游离Glu、半胱氨酸等多种氨基酸的含量以及海马中NMDAR 的最大结合力降低,降低大鼠的学习记忆功能[60]。

2.5 多胺作用位点

多胺(polyamines)是一种低分子量的脂肪族胺,主要包含腐胺(putrescine)、精脒(spermidine)、精胺(spermine)。它们既可由外源食物获得,也可以通过生物体内其他物质合成[61]。多胺对于细胞的生长和分裂至关重要,尤其是在快速增殖的细胞中,如细菌、寄生虫、肿瘤细胞和发育中的大脑[62]。多胺可以支持发育大脑神经细胞的复制、轴突的生长和突触的生成[63]。低浓度下多胺剂量的增多会增强细胞增殖和突触发生,促进学习和记忆[64]。多胺呈碱性,因而含α酸性残基的物质都可以成为其靶点,其中包括NMDAR。多胺对NMDA 的电流有多重影响。多胺的增强效应可分为:非Gly 依赖性刺激作用(饱和Glu 和Gly 会引起全细胞电流增加)[65];Gly 依赖性刺激作用(在Gly 浓度亚饱和的情况下,精胺能增加NMDAR 与Gly 的亲和力,对NMDA 电流有刺激效应)[66]。多胺的抑制效应也可分为:电压依赖性通道抑制作用,以及Glu 受体亲和力降低作用。精胺可以与NMDAR 离子通道结合,并诱导Mg2+细胞外结合位点的电压依赖性通道阻滞[65]。此外,精胺使含NR1/NR2B 的NMDAR 与Glu 的亲和力下降,从而导致受体对谷氨酸盐的敏感性降低[66]。

2.6 NMDAR 的调节因素

2.6.1 pH 值调节因素

NMDAR 对胞内外H+浓度的变化极其敏感,电生理研究发现,pH 值为7.4 时NMDAR-通道的活动已部分被抑制,pH 值为6.6 时海马神经元NMDAR 的活动减至1/2。因此,人为地使细胞外液碱化可增强神经元兴奋性,甚至诱发癫痫样活动;反之,酸化培养液可减轻由缺氧或者兴奋毒性引起的神经元损伤。中枢兴奋性突触在释放Glu 激活突触后膜NMDAR 的同时,还使突触间隙酸化,调节NMDAR 活动的幅度和时程[47]。

2.6.2 氧化还原调节因素

除目前已知的NMDAR-通道大分子上的结合位点可以被药物结合而影响NMDAR 功能外,细胞内外影响因素均可以通过许多方式影响NMDAR。黄辉等[67]报道,采用原位杂交和膜片钳观察NMDAR 的数量和功能。结果发现,胎鼠低压低氧后,NMDAR 数量和通道开放机率以及通道开放时间常数减少,而通道关闭时间常数增加。也有研究显示,脂质过氧化产物对大鼠神经元NMDAR 活性有双相作用,在最初的2 h,脂质过氧化产物可激活NMDAR,但6 h 后NMDAR 活性下降。当脑细胞能量代谢减少和脂质过氧化增加,NMDAR的数目和亲合力也逐渐下降[68]。此外,低浓度活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加和易化海马CA1区LTP[69]。但高浓度ROS 对海马CA1 区的突触传递和LTP 有显著的抑制作用,其作用机制为:氧化剂通过氧化NR1 亚基的多个半胱氨酸残基,抑制NMDAR 介导的电流,从而抑制LTP[70-71]。

2.6.3 突触后致密物调节因素

突触是Glu 释放的部位,也是神经元信息传递的关键部位,突触内外的NMDAR 失衡可以影响神经系统疾病的发病过程[72]。突触功能障碍在AD 中发挥重要作用,因为其可以导致认知能力下降[73]。在与年龄相关的神经退行性变中,认知能力下降与早期突触丧失的相关性比患者神经元丧失的相关性更强[74]。突触蛋白的排列是复杂的,突触活性可以调节兴奋性突触传递的机制。Glu 受体及其偶联的信号转导通路在神经元树突棘上通过各种支架蛋白形成突触后致密物(postsynaptic density,PSD),PSD 是位于中枢神经系统突触后膜胞质面分布的一种均匀而致密的带状或盘状结构,约25~50 nm 厚,宽250~500 nm[75]。PSD 积极参与调节神经递质的分泌、集聚及相应受体的生物功能,在突触可塑性中具有举足轻重的作用,PSD 的厚度可以反映突触功能的活性。

人脑中的PSD 含有1 461 种蛋白,包括膜神经递质受体(NMDAR、AMPA 受体等)、信号蛋白、支架蛋白、细胞骨架蛋白、调节蛋白及修饰酶类等[76-77]。存在于PSD的NMDAR 称为突触上NMDAR,存在于PSD 以外的NMDAR 称为突触外NMDAR。近年发现,PSD 中包含多种相互作用的蛋白质,在介导和整合突触信号传递中发挥重要作用[78]。根据PSD 分子量的重量大小,可以将其分为4 类:PSD-95,PSD-93 及突触相关蛋白97(synapse-associated proteins-97,SAP-97)与SAP102,PSD-95 是含量最丰富、最重要的脚手架蛋白,主要存在于成熟的兴奋性谷氨酸能突触内[79]。PSD-95 因其相对分子质量为95 KDa 而得名,为突触后膜上的受体活动和稳定性所必需,是介导与整合突触信息最重要的突触蛋白[80]。研究表明,PSD-95 有助于NMDAR 的簇集和锚定[81],其作用机制为:一方面,PSD-95 能够形成多聚体,与NMDAR 亚基相结合并锚定于突触后的特定部位;另一方面PSD-95 可以结合NMDAR 信号通路中一系列相关分子,使信号分子、调节分子和靶分子有机地整合于谷氨酸能突触,形成信号复合体,同时与突触前黏附分子相互作用,维持和调节突触的结构状态[82-83]。实验表明,敲除小鼠的PSD-95 基因,其空间学习记忆能力严重受损。此外,PSD-95 转基因动物可以促进海马神经元谷氨酸能突触的成熟,促进突触后Glu 受体的丛集和活性,增加树突棘的数量和大小,表明PDS-95 在突触的发育、稳定和可塑性方面发挥重要作用[84]。

NMDA 的影响因素复杂多样也从另一个方面给予我们启示,就是目前许多影响学习记忆的药物或环境因素,很可能是通过影响或改变NMDAR 的反应性而使NMDAR 功能减弱或增强。而过量的兴奋性氨基酸毒性作用,则很可能由于过强的刺激损毁了NMDAR,导致一系列疾病的发生,并被广泛用于制作学习记忆障碍和细胞毒性病理模型。

3 NMDAR 与学习记忆

NMDAR 是介导神经兴奋最主要的受体,是学习记忆中的关键物质,可调控神经元的激活和死亡,树突、轴突结构发育及突触可塑性,影响神经元回路的形成及学习记忆过程[85]。作为突触可塑性的关键,阻断NMDAR 会干扰记忆的形成和记忆的恢复[86]。早在1993 年,张丹参等发现[87],在跳台法和避暗实验中,给小鼠脑室注射NMDA 1ng 能显著改善乙醇及亚硝酸钠所致记忆障碍,且NMDA 的改善记忆作用可被其受体特异性拮抗剂2-氨基-5-磷戊酸(2-amino-5-phosphonovaleric acid,AP5)所拮抗,脑室给药NMDA主要是影响记忆巩固和再现过程。近年来的多项研究也佐证,NMDAR 的表达可以影响动物[88]和健康人[89]的工作记忆,大脑的记忆力下降与大脑海马区NMDAR的表达异常有关[90]。在脑外伤后1 h 内,NMDAR 明显增高,但随后显著性下降,且持续时间大于7 d;在脑外伤24 h 或48 h 后,给予NMDAR 激动剂,可显著减轻神经损害,并恢复认知功能[91],表明NMDAR 与学习记忆密切相关。此外,在学习记忆过程中还有一些受体、机制及基因可以通过作用于NMDAR,调节学习记忆。

3.1 记忆网络中与NMDAR 相关的受体

3.1.1 记忆网络中NMDAR 与胆碱受体的相关性

早在二十世纪七、八十年代,就发现阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者脑基底核胆碱能神经元相对选择性丢失,胆碱能神经纤维发生退变,从而提出了“胆碱能假说”,此发现促进了学习记忆胆碱能机制的研究[92]。AD 患者最显著的特征是进行性智力障碍,损毁老年大鼠中枢上行胆碱能系统的起始核Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert,NBM),可造成AD动物模型,说明AD 患者脑内胆碱能系统存在多方面功能障碍[93]。解剖学研究表明,老龄Wistar 大鼠前脑胆碱能核团明显缩小(平均缩小26%),神经元数目减少(平均减少27.8%)。动物实验显示,老年记忆减退大鼠额皮质、内嗅区、海马CA1 区胆碱酯酶阳性纤维密度明显降低,且与记忆障碍相关[94]。表明中枢胆碱能系统与学习记忆关系密切,老年学习记忆减退中胆碱能系统的损害也起着重要作用。胆碱能系统中的烟碱和毒蕈碱受体在AD 患者中的表达降低,可以作为治疗AD的药理学靶点[95]。研究表明,不同动物的学习和记忆模型中有基底外侧杏仁核(basolateral amygdala,BLA)的参与[96-97]。BLA 病变使得大鼠记忆巩固和被动回避学习的能力受损。BLA 通过NMDAR 的激活可以调节海马学习和记忆的LTP 过程[98],抑制被动回避记忆的形成[99];也可以增强抗胆碱脂酶剂毒扁豆碱的作用,可以改善回避学习中的记忆恢复[100]。此外,NMDAR的失活或激活可以影响东莨菪碱(毒蕈碱受体的一种非选择性强效拮抗剂),引起失忆,提示BLA 的毒蕈碱与NMDA 在记忆恢复形成中存在功能性的相互作用[101]。研究表明,应用乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)的合成前体胆碱,对老年性健忘症的患者实施胆碱疗法,可以改善老年人的学习记忆能力,达到治疗效果[102]。值得注意的是:胆碱能药物对学习记忆的增强效应与药物的剂量有关,中小剂量起增强作用,大剂量反而抑制或损害记忆[103],因此在治疗过程中应严格控制药物剂量。

Bernard 早在1982 年就报道,NMDAR 可调节由兴奋性氨基酸引起的纹状体ACh 释放[104]。在自发活动、学习、记忆和探究行为等认知活动中,基底前脑胆碱能神经元被激活后,脑内释放ACh[105-106]。皮层神经元可通过维持不同ACh 水平来实现对兴奋性及突触传递效率的精细调节,ACh 的这一效应是通过作用于M 受体影响突触前递质释放而实现的,但NMDAR 和GABA 受体功能均可影响胆碱M 受体的活性[107]。在神经发育过程中,GABA 能神经元中NMDAR 的缺失也会导致社会记忆缺失[108]。MK-801 作为NMDAR特异性最强、效能最高的非竞争性拮抗剂,可快速占领NMDAR 离子通道孔深部的PCP 结合位点,从而阻断Ca2+进入细胞[109]。研究表明,腹腔内注射MK-801,发育期大鼠的空间工作记忆受到破坏[110],海马内注射MK-801 会使得大鼠T 型迷宫位置辨别倒序学习遭到破坏[111]。此外,另有报道表明MK-801 对ACh M 受体亚型基因的调控是控制吗啡戒断症状的机制之一[112],但NMDAR 与胆碱能系统在学习记忆中的确切作用机制尚有待进一步研究证实。

3.1.2 记忆网络中NMDAR 与腺苷A1受体的相关性

腺苷是中枢神经系统内的一种能量代谢产物,随着神经元活动的增加在脑内逐渐积聚,作为调节神经元活动的细胞外信号分子,既可调节神经递质的释放,又可作用于突触后膜使电位超极化,还可与其它受体系统相互作用[113]。腺苷受体包括A1、A2A、A2B 和A3三种亚型,它们都属于G 蛋白偶联受体[114],其在中枢神经系统中的作用主要是通过腺苷A1和A2A 实现的[115]。腺苷A1受体分布极为广泛,在对大鼠各组织原位杂交和受体放射自显影研究发现,腺苷A1受体在脑基底核、海马、小脑等部位细胞表面的分布密度最高[116]。腺苷对于神经通路最显著的作用为抑制兴奋性传递,但腺苷A1受体的位置不同,腺苷的作用机制也不同:突触前A1受体,腺苷通过调节Gi/o 蛋白偶联的电压依赖型Ca2+通道,从而降低兴奋性氨基酸的释放,降低兴奋性突触后电位;突触后A1受体,腺苷通过抑制N 型Ca2+通道和NMDAR 来调节神经传递;突触外神经元的A1受体,腺苷调节K+电流导致神经元超极化[117];非神经元分布的A1受体,可以调节星形胶质细胞和小胶质细胞相关的神经功能[118]。

腺苷A1受体与NMDAR 的分布基本平行[119-120],腺苷A1受体可以抑制海马神经元NMDAR 介导的电流活动[121]。选择性腺苷A1受体激动剂可损害记忆,腺苷A1受体阻断剂则对记忆损害有改善作用[122-124]。例如,在大鼠水迷宫实验中,选择性腺苷A1受体激动剂环戊腺苷(cyclopentyladenosine,CPA)可显著损害小鼠被动回避实验中的学习记忆[125],胞外腺苷的积聚会通过腺苷A1受体作用于局部神经元来降低其兴奋性,进而导致认知功能损害[126];相反腺苷A1受体阻断剂8-环戊-1,3-二丙基黄嘌呤(8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine,DPCPX)则可以对短暂缺氧造成的记忆损害产生保护作用[127]。张丹参等[128-130]研究表明,DPCPX 不直接影响正常记忆过程,可能通过抑制脑内AChE 活性、增加脑内ACh 含量、升高脑内Glu/GABA 比值、诱导增加神经元细胞中内质网数量、增加BDNF 蛋白含量,达到改善记忆障碍的作用。研究结果提示,腺苷A1受体的功能状态直接影响着NMDA 受体的功能,DPCPX的记忆改善作用也有赖于NMDA 受体功能的完整性,DPCPX 通过增强NMDA 受体介导的海马齿状回突触传递活动可能是其改善记忆作用的重要机制[131],以此研究结果为依据,张丹参等[131]提出了“腺苷A1受体很可能与NMDA 受体相偶联并调控NMDA 受体功能”的理论假设,认为腺苷A1受体阻断剂DPCPX 通过阻断腺苷A1受体改变NMDA 受体的功能状态,进而调控学习记忆功能状态。

另有研究显示,NMDAR 非特异性阻断剂MK-801全身给药后,可在大鼠皮层引起神经毒性,但是预先给予CPA 可剂量依赖性减弱MK-801 引起的毒性作用,从另一方面证实了腺苷A1受体激动剂与NMDAR 阻断剂的协同作用[132-133]。表明,NMDAR 与腺苷A1受体之间很可能存在某种内在的联系,二者协同完成对学习记忆的调控功能,这个结论也支持上述理论假设。但NMDAR 与腺苷A1受体之间的在联系的确切机制尚有待进一步研究。

3.2 记忆网络中NMDAR 与LTP 的相关性

在外界环境变化或脑损伤时,突触可塑性使得大脑的结构与功能可以发生相应的变化,涉及神经元、突触及结构与功能的调控[134],其表现形式为突触前神经元释放Glu,与突触后的NMDAR 结合,将信号传递到突触后膜,使突触后电流(excitatory postsynaptic current,EPSC)增加,产生的一系列生化联级反应,包括LTP 和长时程抑制(long-term depression,LTD)。在海马区,高频刺激引起突触后膜的NMDAR 活化,提高信息传递效率,诱导LTP 的形成;反之,则引起LTD,这取决于树突棘中产生的细胞内Ca2+上升的程度和特定细胞内级联反应的下游激活[135]。激活NMDAR 可以诱导LTP 或LTD。其中,LTP 是参与海马依赖性学习和记忆的主要细胞机制之一[136],LTP 是学习和记忆的神经生物学基础[137],参与大脑发育过程中依赖性突触的形成[138],反映了突触水平上的信息贮存过程[139]。LTD的定义是突触对重复低频刺激的长时程减弱[140],这是巩固海马依赖性空间记忆所必需的[141]。诱导LTD 的开关是突触后钙Ca2+的增加。由于突触后Ca2+增多与LTP 和LTD 的诱导有关,普遍认为细胞内Ca2+的快速升高导致LTP 的诱导,而缓慢增加则导致LTD 的诱导。

NMDAR 通道开放是触发LTP 的基础,关于LTP 与NMDAR 有关的第一篇研究报告是1983 年由Collingridge 提出的,他们发现AP5 可阻断强直刺激引起的LTP 效应[142]。张丹参等[143]研究发现,AP5 可抑制LTP,并选择性阻断空间辨别能力的获得,但不影响视力辨别能力,这说明LTP 与学习记忆机制密切相关,NMDAR 对这一过程有调节作用。此外,在老龄小鼠中枢神经系统中,Glu 含量降低,同时NMDAR 数量也显著减少,而且这些变化与LTP 减弱呈正相关[144]。实验表明,LTP 与学习记忆过程有赖于NMDAR 的活化[145],NMDAR 是诱导突触可塑性的门控开关[146],可以调控LTP 的形成[147],在中枢神经系统突触兴奋性传递过程中也发挥重要作用[148]。

LTP 的形成过程为:突触前神经末梢释放兴奋性递质,NMDAR 的突触后膜局部快速去极化,NMDAR通道中的Mg2+被移除,递质与突触后膜上NMDAR 结合并打开离子通道,使Ca2+内流进入突触后膜细胞并触发神经元内一系列生化反应,突触后膜的性质改变,产生LTP[149]。Ca2+大量内流的同时,激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMK Ⅱ)的表达,从而通过CaMK Ⅱ的磷酸化使NMDAR 的磷酸化增加,提高突触信号传递的有效性[150]。LTP 的维持过程为:突触后神经元合成和释放的某些逆行信使物质(如NO、CO)反过来作用于突触前膜,使之维持高水平的递质释放,持续激活NMDAR,使得LTP处于维持状态。若敲除小鼠海马CA1 区的NMDAR基因,会导致NMDAR 通道电流不足,抑制LTP,使小鼠的空间学习记忆功能受损。LTP 具有三个基本特征,①协同性:诱导LTP 需要很多纤维同时被激活;②联合性:有关纤维和突触后神经元需要以联合的形式一起活动;③特异性:所诱导的LTP 对被激活的通路是特异的,在其他通路上不产生LTP[151]。

早期研究指出NMDAR 的NR2B 亚基在突触可塑性和LTP 的形成中发挥重要作用。NR2B 亚基激活后,通过CaMK Ⅱ作用,促进LTP 的形成,LTP 反过来还可以促进NR2B 的表达,从而增强学习记忆的功能。近年来研究发现,NR2B 是最重要的调节亚基结构,与学习记忆关系最为密切,甚至被称为“聪明基因”。无论是皮层区还是海马区的NR2B 下降与学习记忆功能的损伤均表现出明显的相关性。NR2B 亚基过度表达的小鼠,其学习记忆能力显著增强[152]。行为学检测发现,海马组织NR2B 基因敲除的小鼠出现空间或非空间的记忆缺陷[153]。利用转基因的方法,Wang 等[134]制造了在海马体和皮质中NR2B 过表达的转基因大鼠,发现其在空间水迷宫和新物体的识别测试中记忆能力得到了改善。若小鼠海马的NR2B 蛋白含量为普通小鼠的2 倍,其学习和记忆能力显著增强;之后再敲除NR2B的小鼠,NMDAR 反应性下降,NMDAR 依赖的LTP丧失,小鼠空间学习能力受损[155],充分说明NR2B 与LTP 密切相关。此外,AD 患者脑组织中纹状体富集酪氨酸表达增加,使NR2B 亚基去磷酸化增加,进而使得NMDAR 突触表达减少,电活动降低,最终LTP 受影响,这可能是AD 患者学习记忆降低的发生机制[156-158]。

3.3 记忆网络中NMDAR 与BDNF 的相关性

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是从猪脑提取液中获得的,是一种分子量为12.3 kD 的碱性蛋白。BDNF 是神经营养因子家族中重要的一员,广泛存在于大脑皮质、海马、基底前脑、纹状体、下丘脑、脑干和小脑等部位[159],并且在海马内其表达量最丰富[160]。BDNF 可以调控神经元的生长、神经前体细胞和新生神经元的分化、成熟和生存[10],促进神经元再生[162],增加神经细胞间的突触联系,能有效防止神经元的变性及死亡[163],调控海马的突触可塑性和学习记忆能力[164]。BDNF 对兴奋性突触传递和可塑性很重要,在学习和记忆中发挥重要作用[165]。实验证明,BDNF 可以调节鼻周皮层和齿状回中类似和不同记忆所需的可塑性机制[166]。其巩固记忆可塑性的效应机制为,BDNF 可以促进NMDAR 的磷酸化,使NMDAR 的活性增强[167]。

在消除齿状回和前额皮质的空间记忆和形象记忆过程中,NMDAR 直接或间接地与BDNF 相互作用。在某些情况下,NMDAR 是空间模式分离和辨别学习所必需的[168],且在物体识别记忆和空间记忆的形成中发挥作用[169]。BDNF 可以增强记忆辨别能力,但必须激活NMDAR[170]。NMDAR 是BDNF 诱导可塑性改变的调节剂[171],其作用机制为:BDNF 可以通过调节Glu 途径[172]或通过调节NR2B 的磷酸化来选择性调节NMDAR的开放率,从而快速增强突触后传递[173]。但没有证据表明NMDA-BDNF 在前额皮质的体内、体外或海马中在识别重叠记忆时存在类似的相互作用,暗示NMDAR 可能是BDNF 在记忆巩固过程中的效应因子[174]。然而,BDNF 依赖性的LTP 不需要激活NMDAR[175]。在突触前端,BDNF 可增强突触体中Glu 的释放,以及微小兴奋性突触后电流的频率,这种作用具有NMDAR 依赖性[176]。此外,BDNF 可以增加NMDAR mRNA 的翻译[177],这可能依赖于RNA 结合蛋白异质细胞核核糖核蛋白K,通过其对NMDAR 功能的作用,BDNF 可以通过增强树突棘内Ca2+内流,降低LTP 的诱导阈值,进而调节LTP[178]。

在脑损伤发生时BDNF 的表达广泛增加,而且脑组织抵抗损伤的能力与BDNF 表达水平呈正相关[179-180]。在实验中NMDA 可使海马脑片CA1 区BDNF 表达增强,说明当神经元受到外来因素损伤时BDNF 水平提高是一种保护性反应。当细胞外液中NMDA 水平持续增高,构成NMDA 毒性环境,造成细胞损伤,抑制细胞间的突触传递,而此时细胞的自我保护机制亦启动,BDNF 的表达开始增加。房德芳等[181]表明,丙泊酚可通过增强BDNF 的表达,减轻神经元的损伤,使得神经突触之间的连接保持正常,从而促进突触传递效能的恢复。此外,BDNF 基因启动子的组蛋白修饰与恐惧记忆的消退也密切相关[182]。实验表明,慢性应激小鼠出现抑郁样行为以及空间学习记忆能力显著降低,并且海马各区及前脑皮层BDNF 表达降低[183]。慢性应激引起小鼠水迷宫空间学习记忆能力明显减退,脑内海马各区和前脑皮层BDNF 的表达显著降低,但慢性应激后各项指标有部分恢复。表明海马及前脑皮层神经元BDNF 表达的下调,可能参与了慢性应激后小鼠空间学习记忆功能的损伤机制[184]。

研究表明,BDNF 在杏仁核依赖性恐惧条件反射中起作用,其受体酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor,TrkB)是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的调控子,两者是海马依赖性学习记忆的中介,在恐惧性条件反射突触可塑性中具有重要作用[185-186]。BDNF 通过与TrkB 受体结合促进酪氨酸激酶自磷酸化和二聚化,并激活细胞内信号转导途径,调节突触的可塑性[187]。BDNF 依赖于突触后TrkB 的活化,可快速可逆地增加海马和皮层突触NMDAR 依赖的反应[188],同时BDNF 可促进NR1、NR2A 和NR2B的转录和翻译而促进蛋白合成[189]。Mizuno 等[190]已经确定学习和记忆的获得与海马体中BDNF mRNA表达的增多有关,且BDNF 缺陷大鼠在海马依赖性学习和记忆以及海马LTP 方面均出现损伤[191]。表明,BDNF 在减少神经元损伤和记忆损伤及消除恐怖记忆中都发挥重要作用。

Falkenberg 等[192]发现,将大鼠在复杂的环境中饲养能提高它们在Morris 水迷宫训练中的成绩,并增加BDNF mRNA 在海马中的含量;提示海马中BDNF的表达水平可能与动物的学习记忆能力有关。同年Patterson 等[193]报道,能够诱导LTP 产生的刺激模式能升高海马脑片CA1 区神经元内的BDNF mRNA 水平,用外源性BDNF 能迅速增强突触传递功能。Korte 等[194]在整体动物LTP 诱导过程中,在海马齿状回也得到相似的结果;而BDNF 基因敲除小鼠的LTP 出现明显抑制,补充外源性BDNF 后,被抑制的海马LTP 能恢复到正常大小[195-196],其作用机制可能是,BDNF 可以磷酸化海马CA1 区锥体神经元突触后NR1 和NR2 亚基从而诱导LTP,迅速增加神经元间的突触传递[197]。Ma 等[198]研究证实,在大鼠抑制性逃避反应学习的巩固阶段中,学习成绩好的大鼠比学习成绩差的大鼠海马齿状回内BDNF mRNA 的水平明显上升。LTP 是学习和记忆过程的分子水平现象,BDNF 对LTP 起着重要的调节作用,而且对短时程及长时程突触可塑性均有影响[199]。BDNF 参与短时和长时记忆过程,在LTP 的诱导和维持以及海马依赖性学习中起关键作用[200]。BDNF 影响LTP 的诱发和后期维持的作用机制可能是,BDNF 作用于突触前后膜上的受体,使得突触前递质小泡增多从而增加递质释放[201]。这一系列结果表明,BDNF 是突触传递和LTP 的重要调节器,一定程度上可以改变学习与记忆功能。

4 NMDAR 与神经毒性作用的相关性

Glu 是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质,在一定范围内释放增加可增强学习记忆,并对神经系统正常功能的维持起着重要作用[202]。同时,Glu 亦具有神经毒性,其大量释放或在神经系统内的堆积又是神经细胞损伤的关键因素,是许多神经系统疾病如AD、脑缺血、帕金森病、脊髓侧索硬化、癫痫等发生发展的重要因素[203]。

在生理条件下,细胞外多余的Glu 可通过Glu-谷氨酰胺循环被迅速清除[204]。然而,当Glu 释放过度或病理条件下发生循环功能障碍时,更多的Glu 在突触间隙聚集[205],当细胞外Glu 浓度达到2~5 μmol·L-1时,就能引起神经元的损伤[206]。其作用机制包括抑制细胞膜上谷氨酸/ 胱氨酸转运体的功能,产生细胞毒性作用[207-208],该作用以细胞内谷胱甘肽耗竭和活性氧成分升高为主要特征,被称为Glu 的氧化毒性[209-210],对许多神经系统疾病的治疗具有重要意义[211-212]。

同时,Glu 的大量释放可以过度激活NMDA 受体,由于NMDAR 对Ca2+具有高度的渗透性,它们不仅向神经元传递生理信号,而且还可以触发细胞内信号级联,导致细胞死亡。以不同浓度的NMDA 处理海马神经元发现,NMDA(100 μmol·L-1)可引起海马神经元的毒性反应,且呈剂量依赖性和时间依赖性[213]。此外,以NMDA(300 μmol·L-1)处理4 h 也可明显损伤PC12细胞[214]。NMDAR 的过度激活引起大鼠的认知记忆方面出现障碍[215],被广泛用于制作学习记忆障碍和细胞毒性病理模型。

NMDAR 产生神经毒性作用的机制包括:①Ca2+:NMDAR 过度激活,受体通道开放引起Na+、Ca2+内流,细胞内Ca2+浓度增加,细胞肿胀破裂导致神经细胞死亡而产生兴奋毒性,这种迟发性损伤是Glu 兴奋性毒性损伤的主要途径[216-217]。Ca2+进入胞内的动态变化过程主要分为3 个阶段:最初的5~10 min,Ca2+持续进入胞内;随后的2 h,Ca2+在胞内聚积;最终,胞内聚积的Ca2+通过激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS),Ca2+敏感蛋白酶,导致线粒体功能紊乱,细胞能量的衰竭[218-220]。②一氧化氮(nitric oxide,NO):NO 在胞内具有多个靶目标,可以和自由基超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)组成过氧亚硝酸盐[221]。过氧亚硝酸盐具有极强的氧化性,可以引起蛋白硝化、蛋白氧化、脂质过氧化以及DNA 直接损伤,从而导致神经元的死亡[222]。此外,研究发现NO 可以和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)相互作用,直接产生的神经元毒性[223]。在NOS 敲除的小鼠研究中NMDAR 介导的兴奋性毒性可以明显的降低[224]。③自由基:实验证实发生兴奋性毒性时小脑的颗粒细胞和皮质神经元中均有自由基的产生[225]。通过使用磁共振成像可以发现,SOD 的生成量和NMDA的应用具有线性关系[226]。有研究小组通过使用线粒体解偶联剂减少了自由基的生成说明自由基是在线粒体中生成[227],使用抗氧化剂可以在谷氨酸诱导的兴奋性毒性中起到神经元保护作用[228]。深入研究这一作用机制对相关疾病的治疗具有重要意义。

5 NMDAR 与相关疾病

NMDAR 除参与上述学习记忆相关的生理功能外,还广泛参与疼痛[229-230]、免疫[231-232]、睡眠[233]等生理功能,以及癫痫[234]、糖尿病[235]、脑缺血[236]、神经性头痛[237]、阿尔茨海默病[238]、抑郁症[239]、精神分裂症[240]等病理过程,可以作为上述疾病的治疗靶点。

6 结语

综上所述,学习记忆活动在功能复杂多样的中枢神经系统而言,好像一个庞大的信息记忆网络,而NMDAR 就是记忆网络中的一个相对中心环节,许多因素可以通过NMDAR 影响学习记忆功能,而NMDAR也可以通过与其他因素的相互作用,对整个中枢神经系统产生影响,甚至引起各种相关疾病。因此,对NMDAR 在学习记忆网络中的确切地位及调控机制进行深入研究,或许能揭示学习记忆的奥秘,对脑功能的研究有极为重要的划时代的意义。

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