酸枣仁提取物配柴胡提取物组方 促进动物身高增高及机制研究

吴晓龙，谢艳，刘晓红，宁桃丽，殷娜

河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南 洛阳 471002

当今社会，儿童青少年生长发育的一般规律及其影响因素已是生命科学领域不断深化的传统研究课题。在关于生长发育的研究中，身高是重要的形态指标之一。心理学研究发现[1]，身高能够影响个体自身的人格、行为以及心理健康等。生长激素是促进骨骼生长的决定性因素，而生长激素的分泌主要在慢波睡眠期间[2]，有报道慢波睡眠的启动和延长与5-HT有关[3]。笔者的前期实验显示酸枣仁提取物可以促进5-HT1AR的高表达，而柴胡提取物导致了5-HT分泌增多，两种药物均导致生长激素分泌增多并最终导致小鼠身长的增长[4,5]。本实验在前期研究基础上进一步对酸枣仁提取物配柴胡提取物组方促身体增长的作用及机制进行研究。

1 动物、材料及仪器

1.1 实验动物昆明种小鼠30只，SPF级，雌性，体重15～17g，动物许可证号SCXK(豫)2015-0001 。SD大鼠30只，SPF级，雌性，体重120～150g，动物许可证号SCXK(豫)2015-0001，来自同一时期每胎6只10胎的小鼠60只，体重26～28g，动物许可证号SCXK(豫)2015-0001，均由河南省实验动物中心提供。动物饲养环境温度(20～24)℃，湿度50%～70%，12h明暗交替，光照7:00～19:00，噪音＜50dB。

1.2 药物与试剂酸枣仁提取物，由陕西斯诺特生物技术有限公司提供(含皂甙3%～5%，市场名称为酸枣仁皂甙，实为提取物，天然酸枣仁中含皂甙0.1%～0.14%)，使用时小鼠按照0.32mg/g体重灌胃，大鼠按照0.22mg/g体重灌胃。柴胡提取物，由西安四季生物技术有限公司提供，其中柴胡皂甙含量为5%(市场称为柴胡皂甙，天然柴胡中柴胡皂甙含量为0.006‰～0.007‰)，使用时小鼠按照0.94mg/g体重灌胃，大鼠按照0.66 mg/g体重灌胃。酸枣仁皂甙A，(纯度＞98%，购于中国食品药品检定研究院，批号A0274)，小鼠按照0.013mg/g体重灌胃，大鼠按照0.009mg/g体重灌胃。5-H T1A受体选择性抑制剂P-MPPF，购于北京盛科博源生物科技有限公司；5-H T合成抑制剂LX1606，购自Selleck(批号：s2173)。小鼠5-HT1AR ELISA试剂盒(上海纪宁实业有限公司，批号201510)；Tris Base(Amresco Lot:D0194)；TritonX-100(北京化学试剂公司，批号：050205)；3H-8-OH-DPAT0.25mci(放射性比活度135ci.mmol-1)(New England Nuclear公司)；2,5二苯基噁唑(PPO)(sigma公司，Lot:D4630)，1,4-双(5-苯基-2-噁唑基)苯(POPOP)(sigma公司，Lot:P3754)；考马斯亮蓝G-250(Solarbio公司，Lot:0120310)。

1.3 仪器酶标仪(Labsystems Multiskan MS，芬兰，352型)；离心机(北京雷博尔离心机有限公司，LDZ5-2型)；RM-6000八导生理记录仪(日本光电)；AB-621G生物电放大器(日本光电)；FZG-81直流前置放大器(上海嘉龙仪器厂)；脑立体定位仪(西北光学仪器厂)；FJ2107-P液体闪烁计数仪(西安262厂)。

2 方法

2.1 药物对小鼠发育期体长的影响来自于同一时期10胎的小鼠，每胎3只，随机分在3组，分别为空白组、酸柴提取物及阳性对照组，每组10只，3组小鼠原始体长无统计学差。酸柴提取物组灌胃酸枣仁加柴胡提取物混悬液，阳性对照组灌胃酸枣仁皂甙A水溶液，空白对照组灌胃纯净水。各组于灌胃后第20天分别麻醉动物，用直尺测定小鼠体长，从头部最顶端到小鼠臀尾交接处即为小鼠体长，精确到1mm。

2.2 小鼠血中生长激素的含量测定各组小鼠灌胃20d测定体长后麻醉状态下取血并处死，于室温下待血液自然凝固20min，以离心半径3000 r·min-1离心20min，收集上清液，采用ELISA试剂盒测定GH水平。

2.3 放射性配体受体结合法监测5-HT1A受体配体的结合活性[6]同一时期出生的来自10胎的每胎6只小鼠，随机分为6组，分别为空白对照组，蓝墨水组，酸柴提取物组，阳性对照组，5-HT抑制剂LX1606组和5-HT1AR抑制剂P-MPPF组，每组10只。酸柴提取物组灌胃酸柴提取物混悬液，阳性对照组灌胃酸枣仁皂甙A水溶液，空白对照组和蓝墨水组灌胃纯净水，5-HT抑制剂组除了灌胃酸柴提取物外，最后一次灌胃后，侧脑室注射加了蓝墨水的LX16063mg/kg体重，5-HT1AR抑制剂组除了灌胃酸柴提取物外，最后一次灌胃后侧脑室注射加了蓝墨水的P-MPPF8μg/只。除了空白组最后一次灌胃后侧脑室注射生理盐水，其余各组侧脑室注射等量蓝墨水。30分钟后断头处死小鼠，迅速剥离脑组织，取蓝墨水一侧(各组蓝墨水的加入是为了解剖后确定药物是否注入脑室)，加入PBS缓冲液，在冰上匀浆。低温12000r·min-1离心30min，弃上清，离心3次，沉淀加入3mL Tris-HCL缓冲液，混合后放于37℃水浴锅中孵育10min后，4℃12000r·min-1离心30min，弃上清，将沉淀用1.8mL的Tris-HCL反应液匀浆混匀后加样。孵育30min，0℃冰冷的Tris柠檬酸缓冲液负压抽滤，将滤膜置于闪烁杯中，加入甲苯-TritonX-100闪烁液5m L，放置过夜，于闪烁计数仪上测定发生性(cpm值)。采用考马斯亮蓝法测定突触膜中的蛋白的浓度，计算3H-Muscimol的结合量(以每毫克蛋白质结合的3H-Muscimol的克分子数表示)。特异性结合量=[(样品总结和-非特异性结合)。

2.4 药物对大鼠慢波睡眠的影响由于小鼠体积太小，不方便在脑部安装电极，所以用大鼠做此实验。30只大鼠随机分为5组(空白对照组、酸柴提取物组、阳性对照组、5-HT抑制剂组合、5-HT1AR抑制剂组)，每组6只，以3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，剪去颅顶的毛，沿颅顶矢状线切开皮肤，分离皮下组织，暴露颅骨并打孔，分别在枕叶和颞叶放置电极记录脑电图(electroencephalogram,EEG)；分离颈部肌肉放置电极记录肌电图(electromyography,EMG)；打开额窦，放置电极记录眼电图(electrooculogram,EOG)。将各电极导线和微型插座相连接，用自凝牙托水拌牙托粉固定在颅骨上。术后给青霉素肌注抗感染。恢复一周后，记录大鼠的EEG、EMG和EOG，连续记录6h(10:00—16:00)。分析时，以每15秒为一段，采用WXL睡眠自动分析系统，根据它们的变化综合判断慢波睡眠时长，慢波睡眠时期的特征为：脑电波频率变慢，α波减少，“梭形”波消失，出现θ波，最后出现高振幅的δ波；肌张力降低，四肢无明显运动或抽动；呼吸循环和交感神经的活动水平降低，但仍稳定，表现为瞳孔缩小、心率与呼吸频率减慢、血压降低、体温下降等。计算6h内觉醒期(W期)、慢波睡眠期(SWS期)和异相睡眠期(PS期)及总睡眠期(TS期)的时长，连续记录3d。每一动物取均值。统计5组动物慢波睡眠时长无差异。然后开始灌胃药物，每日1次，于第3天最后一次灌胃后，5-HT抑制剂组侧脑室注射LX1606，5-HT1AR抑制剂组侧脑室注射P-MPPF。末次灌胃30min后，同样记录EEG、EMG和EOG，分析用药后5组大鼠睡眠情况。

2.5 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件进行统计处理，计量资料以()表示，数据采取完全随机设计资料的方差分析，P＜0.05时差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 药物对小鼠发育期体长的影响统计结果显示，灌胃20d后酸柴提取物组动物体长均较空白组长，差异有显著统计学意义(P＜0.01)结果见表1。

3.2 药物对小鼠血清生长激素含量的影响酸柴提取物可以促进大鼠体内GH的分泌，与空白组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)，而与阳性组作用相当，差异无统计学意义，结果见表2。

3.3 小鼠脑组织5-HT1A受体配体结合活性的影响酸柴提取物对小鼠脑组织5-HT1A受体配体结合活性与空白对照组比有显著性差异(P＜0.01)，而与阳性对照组作用相当，差异无统计学意义，蓝墨水组与空白组结果相当，证明蓝墨水对实验结果无影响，结果见图1，表3。

3.4 药物对大鼠慢波睡眠的影响酸柴提取物可以促进大鼠慢波睡眠延长，与空白对照组比较P＜0.01，但并不引起异相睡眠的改变，药物组与酸枣仁皂甙A作用相当。总睡眠时长方面酸柴提取物组和阳性对照组均较空白组延长，有显著统计学意义，结果见表4。

表1 酸柴提取物对小鼠体长的影响(±s)

表1 酸柴提取物对小鼠体长的影响(±s)

注：与空白对照组比较,1)P＜0.05；2)P＜0.01

表2 酸柴提取物对小鼠血清生长激素含量的影响(±s)

表2 酸柴提取物对小鼠血清生长激素含量的影响(±s)

注：与空白对照组比较,1) P＜0.05；2)P＜0.01

图1 加有蓝墨水的药物侧脑室注射效果对比

表3 酸柴提取物对小鼠脑组织5-HT1A受体配体结合活性的影响(±s)

表3 酸柴提取物对小鼠脑组织5-HT1A受体配体结合活性的影响(±s)

注：3)与酸柴组比较P＜0.01

表4 酸柴提取物对大鼠慢波睡眠的影响(±s)

表4 酸柴提取物对大鼠慢波睡眠的影响(±s)

注：3)与酸柴组比较P＜0.01

4 讨论

目前批准上市的药物中没有适应证是具有促进慢波睡眠的药物，笔者前期实验与报道都提示酸枣仁皂甙A促进慢波睡眠作用较好，所以本实验选用酸枣仁皂甙A为阳性对照。

儿童生长发育所必需的的生长激素主要在睡眠状态下才能高水平的分泌。尤其是慢波睡眠阶段生长激素的分泌量占每日生长激素的大部分[7]。我们的实验结果显示，给予动物促进慢波睡眠的药物确实可以引起动物体长的增长，且血中生长激素的含量均有所提高。

5-HT是作用于睡眠-觉醒周期的重要单胺类神经递质。Hoeller AA等[8]报导慢波睡眠的启动和5-羟色胺有关。姜岩岩等[9]发现，孤束核注射5-HT的大鼠觉醒期缩短，异相睡眠及慢波睡眠延长，而且5-HT1A受体激动剂可以增加SWS，所以提高脑内5-HT或5-HT1A受体都可以促进慢波睡眠的增多。我们前期的研究显示，可以增加大鼠脑内5-HT1A受体的表达，同时对慢波睡眠时长有显著延长，柴胡提取物可以增加脑内5-HT的含量，也可以增加小鼠慢波睡眠时长和生长激素的分泌，最终也导致小鼠身高的增高。本实验中我们在动物最后一次灌胃后侧脑室注射特异性5-HT抑制剂和5-HT1A受体抑制剂，发现给予抑制剂组的动物5-HT1A结合活性降低且慢波睡眠时间缩短，因此推测酸枣仁柴胡提取物是通过调节动物体内5-HT1A受体与5-HT增多，从而使5-HT受体配体结合活性增强发挥作用，这可能也是两种药物配伍促进生长激素分泌增多及最终体长增长的原因所在。

目前，关于中药促进睡眠的作用及相关机制研究的文献不少，而将药物促进睡眠与身高增高相结合的实验研究不多，我们的研究将会对人体增高的研究提供新的思路。酸枣仁为卫生部首批公布的药食同源类品种，具有安全、有效，并有着悠久的应用基础经验，其开发利用价值前景极为广阔。通过我们的研究将会为今后发现一些基本无毒副作用、经济实惠的促进发育期青少年身高增高的新方法提供前期理论和实验基础。