C57BL/6J、129/SvJ及其杂交一代小鼠的行为学比较研究

万颖寒, 沈如凌, 王 珏, 龚 慧, 李 俊, 董 茹, 费 俭,2

(1. 上海实验动物研究中心/同济大学生命科学与技术学院模式生物技术联合实验室, 上海 201203；2. 上海南方模式生物科技股份有限公司 上海模式动物工程技术研究中心, 上海 201318)

小鼠是第一个实现转基因和基因敲除的哺乳动物, 是人类疾病建模的首选模式生物[1]。近交系小鼠的基因高度纯化，仅有不到1%的基因存在杂合性。利用近交系小鼠，人们已建立了大量与人类疾病相关的基因工程小鼠模型，极大地丰富了我们对人类基因功能和疾病发病机制的了解[2]。大部分基因工程小鼠是建立在某个特定近交品系的，基因工程小鼠的表型不仅来源于对靶基因的改造，还强烈地受到遗传背景的影响，同一个基因突变在不同品系背景小鼠上可能出现不同的表型，其中也包括行为学表型[3,4]。所以了解不同近交系小鼠及其杂交后代的基本表型特征及差异对于解释基因工程小鼠的表型研究结果是至关重要的。目前，构建和繁育基因工程小鼠常用的近交品系为C57BL/6J和129/SvJ。然而，对于C57BL/6J和129/SvJ及其杂交后代在行为上的差异尚缺少系统的比较研究。本文通过对近交系小鼠C57BL/6J、129/SvJ以及它们F1小鼠的行为研究, 了解不同背景小鼠的行为差异, 为解释遗传背景对基因工程小鼠行为学表型的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6J、129/SvJ及F1小鼠, 8～15周龄，均由上海南方模式生物科技股份有限公司提供[SCXK(沪)2014-0002]。所有动物实验均在屏障设施 [SYXK(沪)2013-0035] 中完成，小鼠饲养在恒温(21～22 ℃) 房间, 每隔 12 h 光暗循环(光照7∶00 am～19∶00 pm)。每日小鼠自由进食标准鼠粮及饮水。动物实验方案获得上海南方模式生物科技股份有限公司动物伦理委员会的批准(20140001, 20160008)。

1.2 主要试剂和仪器

旷场实验、被动回避实验仪器购自美国Kinder Scientific Company LLC公司； 水迷宫实验、悬尾实验、鼠博士动物行为学分析系统均购自上海移数信息科技有限公司；热板仪器购自美国IITC Inc公司。

1.3 动物交配繁育

C57BL/6J(B6), 129/SvJ(129)小鼠同品系交配及品系间交配繁育得到雌雄两种亲代和F1代小鼠,每组小鼠需要交配繁育至少6笼, 以确保亲代小鼠[B6(C57BL/6J♀×C57BL/6J♂)、129(129/SvJ♀×129/SvJ♂)、和F1代小鼠[129B6F1(129/SvJ♀×C57BL/6J♂)、B6129F1(C57BL/6J♀×129/SvJ♂)]♂♀比例及数量不少于12只。

1.4 行为学实验

用于行为学实验小鼠为8～15周龄、体质量20～25 g的成年小鼠，实验前一周将小鼠转移至实验场所的IVC动物房饲养, 使之适应新的环境。

小鼠的行为学实验均在独立安静的房间内进行, 测试和记录的房间与操作人员的观察房间分离。小鼠在实验开始之前, 移入实验环境，适应30 min。每个小鼠测试完成后，取走动物，清理仪器装置中小鼠留下的尿液和粪便, 用体积分数75 %乙醇溶液擦拭小鼠接触过的区域, 并用吸水纸擦去残余乙醇，待乙醇挥发后再放入另一只小鼠进行测试, 保证小鼠之间不会因气味相互影响。

行为学实验选择了针对焦虑、抑郁、学习记忆活动、热痛等测定指标，实验强度从低到高安排(图1), 实验之间确保小鼠得到充分休息。

1.4.1 旷场实验 小鼠的运动具有趋壁性，天生害怕空旷场地，喜欢在边缘和角落活动，因此旷场实验利用一个大面积开放的区域作为刺激源使小鼠产生焦虑感，评价小鼠的探究行为、自主活动以及紧张度[5]。实验在方形有机玻璃盒中进行，上方有日光灯照明,小鼠自由探索15 min。小鼠的运动轨迹由红外探测记录，传输至系统软件分析(KS moter monitor)。

1.4.2 悬尾实验 利用小鼠在尾巴被悬吊的短期、不可避免的压力下，会形成一种不动的姿势，来评估小鼠的抑郁程度[6]。使用医用胶布将小鼠的尾巴吊在距桌面50 cm高的金属环上。摄像头记录小鼠的活动。实验持续时间为6 min, 0～2 min为适应时间, 分析统计2～6 min小鼠的不动时间。

1.4.3 水迷宫实验 水迷宫是对啮齿类动物空间学习的测试，它依靠远端线索从开放游泳场所周边的起始位置导航到水下逃生平台，专门用来评估小鼠空间学习和记忆能力[7]。实验参考文献[8,9]设置，分7 d进行： 1 d为适应期，水中不设逃生平台，池壁上不贴标记位置的白纸片，小鼠面朝池壁被放入水池中，自由游泳2 min。2～6 d为训练期，在水中设逃生平台，在池壁贴上标记位置的白纸片，平台隐藏在水下1 cm处。每日每只小鼠分别从4个象限被放入水池中进行4次训练。第7日为测试期，水中不设逃生平台，池壁上保留标记，游泳1 min，上方摄像头记录小鼠游泳轨迹。

1.4.4 被动回避实验 利用厌恶刺激来达到学习的目的, 评估啮齿类动物的学习记忆能力[10,11]。实验分3 d进行： 1 d为适应期，将小鼠放入明场令其探索30 s, 之后打开闸门, 让小鼠在明暗场中自由探索，时间5 min。24 h进行训练，将小鼠放入明箱中，30 s后打开闸门，观察到小鼠四肢全部进入暗箱, 关闭闸门, 给予小鼠0.3 mA持续3 s的电流刺激，电流刺激过后30 s，拿出小鼠。48 h进行测试，将小鼠放入明箱，5s后打开闸门。小鼠的运动轨迹由红外探测记录，传输至系统软件分析(KS moter monitor)。

1.4.5 热板实验 实验在被均匀加热的黑色阳极氧化铝板上进行。IITC热板镇痛实验用于小鼠的热敏感潜伏期测试。打开热板装置，将热板表面加热至(55±0.2) ℃的恒温。将小鼠放在热板上，并被一个透明的丙烯酸保护套包围，当测试的小鼠显示舔后爪，轻拂或跳跃时，立即从热板上取出小鼠并放回笼中，记录时间[12]。

1.4.6 统计分析 采用Graphpad5.0软件进行统计分析，使用ONE WAY ANVOA和TWO WAY ANVOA方法统计，并作图。数据用±s表示，P＜0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 旷场实验

图2 雄性小鼠旷场活动表现

旷场实验结果(图2)显示, 雄性组小鼠129相比于B6在边缘活动的时间显著增长(P＜0.001), 在中央区域的活动时间显著减少(P＜0.001)。 129在中央区域与边缘区域的运动路程比、运动时间比显著低于B6(P＜0.001)。F1分别与129、B6比较，在边缘活动的时间显著低于129(P＜0.001)； 在中央区域活动时间显著高于129(P＜0.001)； 在中央区域与边缘区域的运动路程比、时间比显著高于 129(P＜0.01)。

图3显示，雌性组小鼠129相比于B6在边缘活动的时间显著增长(P＜0.001)，在中央区域的活动时间显著减少(P＜0.001)。129在中央区域与边缘区域的运动路程比、运动时间比显著低于B6(P＜0.001)。F1 分别与129、B6 比较, 在边缘活动的时间显著低于129(P＜0.001), 129B6F1显著高于B6(P＜0.05)； 在中央区域活动时间显著高于129(P＜0.001)，129B6F1 显著低于 B6(P＜0.05)； 在中央区域与边缘区域的运动路程比、时间比显著高于129(P＜0.01), 129B6F1运动路程比、时间比显著低于B6(P＜0.01,P＜0.05)。

2.2 小鼠悬尾实验

结果显示， 各实验组不动时间差异均无统计学意义(表1)。

表1 小鼠悬尾实验抑郁样指标

2.3 水迷宫实验

图3 雌性小鼠旷场活动表现

不同背景来源的雄鼠水迷宫结果(图4)表明，随着训练时间增加， B6和129找到和爬上逃生平台的潜伏期都会缩短，但差异未达到统计学意义。129B6F1和B6129F1找到和爬上逃生平台的潜伏期都会显著缩短(P＜0.01)。对各组小鼠的潜伏期曲线进行比较：B6比较129B6F1，在2～5 d均存在统计学差异(P＜0.01)； 129比较129B6F1，在4d、5d存在统计学差异(P＜0.05)； 129比较B6129F1，在5 d存在显著性差异(P＜0.05)。B6129F1在原平台所在象限的游泳时间显著高于B6(P＜0.05)。

雌性小鼠结果(图5)显示, B6和129找到和爬上逃生平台的潜伏期都会缩短, 且129在5 d显著低于B6(P＜0.05)。129B6F1和B6129F1找到和爬上逃生平台的潜伏期都会显著缩短(P＜0.01)。对各组小鼠的潜伏期曲线进行比较：B6比较129B6F1和B6129F1，在5d均存在统计学差异(P＜0.005)。B6比较B6129F1, 在5d存在统计学差异(P＜0.05)。B6129F1的穿越平台次数显著高于 B6(P＜0.05)。

2.4 被动回避实验

从表2可见, 雄性组B6在3 d进入暗箱的潜伏期显著低于129、B6129F1(P＜0.01)。雌性组B6在3 d进入暗箱的潜伏期显著低于129(P＜0.001)。129B6F1和B6129F1在3 d进入暗箱的潜伏期显著高于 B6(P＜0.001)。

各组小鼠在3 d测试期进入暗箱的时间显著高于1 d、2 d训练期(P＜0.001)，在训练2 d小鼠电击后进入暗箱的时间显著低于1 d(P＜0.001)。

2.5 小鼠热痛活动表现

B6在热板上反应时间显著低于129(P＜0.01)。雄性组小鼠129B6F1在热板上的反应时间显著低于129(P＜0.01)； B6129F1在热板上的反应时间显著高于 B6(P＜0.001)(图 6)。

3 讨论

我们利用一组行为实验研究了B6、129以及它们的杂交后代小鼠的行为学表现。旷场活动中，129比B6表现出更高的焦虑水平，F1在旷场中表现偏向于B6；抑郁样行为测试中，各小鼠组之间没有统计学差异；在学习记忆测试中，129的学习记忆能力比B6强，而F1和129接近，在水迷宫则表现出更大的优势；热板测试中，B6对热痛比129更加敏感，在F1中，其行为主要由父系决定。

旷场实验是广泛用于评估啮齿类动物焦虑样状态和测试抗焦虑药物药效的最常用测试手段[13]，测试是基于接近/回避冲突，动物表现出更愿意探索明亮、开放和升高的区域被认为“低焦虑水平”。本文结果表明, 129较B6表现更为焦虑, 这也与文献报道[14,15]吻合。我们发现F1代在焦虑行为上主要受到B6的背景影响，在旷场实验中F1代雄性小鼠与129之间存在统计学差异(P＜0.001),但和B6无显著差异，因此B6背景更多地影响了F1在旷场环境下焦虑行为的表现，相对显性。

图4 雄性小鼠水迷宫表现

图5 雌性小鼠水迷宫表现

表2 小鼠被动回避潜伏期 s

在学习记忆测试中，我们考察了小鼠在水迷宫和被动回避实验的认知表现。认知和信息加工能力的评估是精神疾病机制研究和认知增强药物临床前研究的重要工具[16,17]。水迷宫实验评估小鼠空间学习和记忆能力，是揭示海马依赖性空间学习记忆能力改变的敏感方法[18]。被动回避实验以电击的方式给予小鼠一个厌恶刺激促使其违背先天的偏好，达到评估其学习能力的目的。被动回避是一种杏仁核依赖性测试，评估小鼠学习和保持联想规则的能力。在水迷宫中B6和129行为表现没有显著性差异，统计发现在目标象限活动时间和穿台次数上129表现出学习能力略优于B6(P=0.06，P=0.07)，若增加样本数，也许结果会有显著性的差异。在被动回避实验中，129对电刺激的敏感度和记忆能力显著高于B6。F1表现出比两种亲代显著优异的空间学习记忆能力，但在被动回避表现上与129差异不显著，因此在决定学习记忆方面，129背景影响相对显性。

在热痛敏感性测试中，雄性F1对热敏感的行为特征和父代亲本品系类似，表现出父系遗传的特点，但该遗传特征在雌性F1中没有观察到，而是表现为和129背景更接近。

图6 小鼠热板活动表现

小鼠的行为特征是深受品系背景影响的, 而年龄的差异也会对小鼠的行为产生不同的影响，造成数据的不一致，说明了表型和基因型之间的复杂关系。大规模行为测试数据分析表明, B6小鼠从成年到中年(2～3、4～5、6～7、8～12 月龄组)，在明暗箱、旷场活动、高架十字迷宫、爬杆、社交互动、预脉冲抑制、强迫游泳、悬尾实验的各种行为表现中存在与年龄相关的变化[19]。我们曾经研究过10周龄B6和129小鼠在水迷宫中的表现，结果发现B6的表现更好，和本次我们用的14周左右的小鼠的研究结果不一致[20]。

了解不同近交系小鼠的基本行为表现对于神经系统基因及精神科疾病机制研究尤为重要。本文初步探讨了B6、129以及其杂交后代F1的行为表现, 为基因工程小鼠的表型研究提供了基础数据。