斑马鱼甲状腺肿大病例分析

李英娘, 戴 玮, 盛 健

(浙江大学医学院, 杭州 310000)

斑马鱼作为模式生物有其独特的优势，如早期胚胎透明，体外受精发育等便于我们实时观察其发育变化。2018年10月在武汉召开的第四届全国暨全球华人斑马鱼Principle Investigator(PI)大会有来自不同国家、地区的260多位代表参会。从中看出越来越多的研究学者把斑马鱼作为实验模式生物。健康的斑马鱼是保证科学研究的基础，但目前国内缺乏标准化的斑马鱼饲养管理办法，并且关于斑马鱼疾病的研究也相对较少。

2017年5月份作者所在的斑马鱼实验室发生了较大规模的斑马鱼甲状腺肿大现象。甲状腺肿大在人群中也是一个比较常见的疾病，人类的甲状腺肿大主要是由于缺碘或者碘过量引起的，中国从1995年开始，强制实行食用盐加碘，国民的碘营养不良状况明显得到改善[1]。碘与甲状腺炎的发病密切相关[2]。甲状腺癌是内分泌系统疾病中常见的恶性肿瘤[3]，碘的摄入量不当也会引起该疾病，与适碘地区相比，分化型甲状腺癌多发生在水源性高碘地区[4]。本文将进一步研究斑马鱼甲状腺肿大的病因，通过HE染色和透射电子显微镜观察病变组织，同时设计了有碘和无碘饲养组，并分析甲状腺相关基因的表达差异，为今后该疾病的治疗和预防提供一些科学依据及候选模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 病鱼的特征 病鱼来源于浙江大学医学院斑马鱼平台，成鱼的养殖密度是15～20尾/3 L 的养殖缸，品系是AB。肉眼能观察到病鱼甲状腺肿大，不同个体肿大程度有差异，但患病的鱼能正常游动，正常摄食，也能正常产卵。

1.1.2 仪器和试剂 斑马鱼养殖单元(上海海圣生物技术有限公司)，全自动样品快速研磨仪(上海净信科技公司), 体视荧光显微镜(Nikon SMZ18)，正置荧光显微镜(Nikon ni)，荧光定量PCR仪(罗氏 480II)，透射电子显微镜(FEI tecnai 10)。

SYBR Premix和提取RNA的试剂盒(南京诺唯赞生物公司)，丰年虫卵(天津丰年水产养殖有限公司)，海盐(浙江蓝海星盐制品有限公司)，片状混合饲料(广东江门海豚饲料)，其他试剂均由国药生产。

图1 甲状腺肿大病鱼

1.2 饲养条件

斑马鱼的养殖系统水都是经过去离子纯水仪处理的自来水。养殖系统里会自动加入适量的分析纯氯化钠和分析纯碳酸氢钠, 系统的pH值7.2～7.4, 电导率 485～510 μs/cm, 水温 28～29 ℃，光暗时间： 14 h∶10 h。每日早晚饲喂孵化好的丰年虫2次，孵化丰年虫使用分析纯氯化钠和分析纯碳酸氢钠。

1.3 实验方法

1.3.1 HE染色 固定组织： 先用1 mg/mL Tricaine溶液将患有甲状腺肿大的斑马鱼麻醉猝死, 随后整条鱼放入10 mL的体积分数10%甲醛溶液固定7 d。再通过包埋、切片、染色。HE染色可以将细胞核染为紫蓝色, 细胞质和细胞外基质染为红色。

1.3.2 透射电子显微镜观察 冷冻猝死患病斑马鱼, 在显微镜下取下突起的红色病变组织(甲状腺),用1 mL 体积分数2.5%戊二醛PBS缓冲液4 ℃固定超过1个月。再通过包埋、超薄切片、染色。

1.3.3 检测使用分析纯氯化钠和海盐养殖水内碘含量 分别收集使用分析纯氯化钠养殖的循环水500 mL，和海盐养殖的循环水500 mL。收好的样品放在-20 ℃贮存。样品送青岛斯八达分析测试有限公司检测，检测水体里碘元素的浓度。

1.3.4 有碘和无碘饲养 有碘组养殖水：直接从海圣循环养殖单元中取出，养殖单元中系统自动加入适量的海盐和碳酸氢钠，电导率控制在490～510 μs/cm，pH 值控制在7.2～7.4。

无碘组养殖水： 10 L的纯水(分析纯氯化钠35 g、碳酸氢钠2 g、氯化钙 1 g、氯化钾0.5 g)。

1.3.5 荧光定量PCR法检测基因表达差异

1.3.5.1 提取RNA 每个实验组设置3个重复，随机挑选受精后7 d (7dpf) 50尾作为一组，挑选60 dpf 的5尾作为一组。先加入1 mg/mL Tricaine将鱼猝死，随后加入裂解液,并用全自动样品快速研磨仪震动40 s使斑马鱼组织完全裂解，然后用试剂盒提取RNA。

1.3.5.2 甲状腺相关基因的表达 具体检测基因及序列如表1。

2 结果

2.1 斑马鱼甲状腺组织HE染色

正常情况下斑马鱼的甲状腺组织是弥散分布的，图中空泡较大的区域都是甲状腺。如图2所示甲状腺(A)弥散分布在斑马鱼头部,并且可以观察到甲状腺滤泡(D)肿大的现象。

2.2 透射电子显微镜镜观察

正常核仁比较圆润，正常线粒体内部分布了很多的线粒体嵴。患有甲状腺肿大的病鱼，其核仁形态异常，线粒体肿大且自溶，细胞已经有调亡的趋势，如图3所示。

2.3 分别检测使用分析纯氯化钠和海盐的养殖水内碘含量

使用分析纯氯化钠养殖的循环水碘的浓度小于方法检出限, 海盐养殖的循环水碘浓度为7.87 μg/L。

表1 甲状腺素相关基因引物序列[5]Table 1 Primer sequences for thyroid hormone gene

图2 斑马鱼甲状腺组织HE染色观察图

图3 斑马鱼甲状腺组织透射电子显微镜观察

2.4 甲状腺相关基因的Ct值

两种饲养条件下饲养7 dpf的小鱼对比，检测的5个基因，只有CRF基因表达有差异，无碘组表达量低于有碘组(P＜0.05)。两种饲养条件下，60 dpf的小鱼对比，5个基因的表达都无差异。同一饲养条件下，不同日龄小鱼的基因表达量有差异，详见表2。

3 讨论

3.1 CRF、TSHβ、NIS、TG、TPO基因相对表达量的差异

CRF能调节甲状腺激素的合成。促甲状腺素β(TSHβ)是一种垂体激素, 能促进甲状腺合成甲状腺素(T4)[6]。钠碘同向转运体(NIS)可以将碘转运到甲状腺滤泡细胞里面[7,8]。甲状腺球蛋白(TG)的数量能直接反应甲状腺功能是否正常。甲状腺过氧化物酶(TPO)是甲状腺激素合成的一种酶, 可以将碘化离子氧化成碘[9]。本实验无碘条件下饲养7 dpf斑马鱼,CRF基因的表达量明显低于有碘组,CRF的表达量降低会引起促甲状腺激素分泌减少，表明碘对CRF基因的表达可能有调控作用。

表2 比较CRF、TSHβ、NIS、TG、TPO相对表达量的Ct值和P值

3.2 线粒体肿大和甲状腺肿大的关系

线粒体肿大在很多疾病中常被提到，过量的服用铁和大量的饮用酒精都会导致线粒体肿大[10],注射内毒素也会观察到肝脏线粒体肿大[11]。线粒体功能的异常也会导致很多的疾病，例如耳聋、心脏病、帕金森病、癌症等[19]。当机体细胞损伤时线粒体肿大是比较常发生的，肿大的线粒体会出现线粒体基质变浅，有些嵴甚至消失。内共生假说认为，线粒体的形成是原核细胞吞噬了好氧细菌，两者经过长时间的互作关系，形成一个共生体[12]。本实验室甲状腺肿大的斑马鱼数量逐渐增多以后，通过调整饲养条件，一个月后甲状腺肿大大部分都消失，在斑马鱼身上的甲状腺肿大是可逆的。线粒体相比于其他的细胞器，是一个比较独立的细胞器，当机体内发生不利于线粒体生存的条件时，它们能快速做出响应。线粒体肿大和甲状腺肿大是如何发生的，它们之间存在什么关联，有待进一步研究。

3.3 缓解斑马鱼甲状腺肿大的方法

首先把养殖系统里使用的分析纯氯化钠换成海盐，海盐里含有多种微量元素更加有利于斑马鱼的健康。发病前斑马鱼养殖水体的温度是28～29 ℃； 发病以后我们将温度调低, 水温控制在26～27 ℃。发病前每日是投喂2餐孵化好的丰年虫, 发病以后改为1餐丰年虫, 1餐片状混合饲料。

3.4 人类甲状腺肿大的模型价值

缺碘或者碘摄入过多都会引起甲状腺疾病，缺碘情况下甲状腺激素的合成不足，促甲状腺激素会增多，会导致甲状腺上皮细胞的过度增生，表现为甲状腺肿大[12,13]。甲状腺肿大是一种对慢性碘缺乏症的生理适应[14]。斑马鱼缺碘出现甲状腺肿大与人类缺碘引起的“大脖子病”有同样的机制及表型，是人类大脖子病的潜在模型。

3.5 推行标准化斑马鱼饲养管理制度

2013年第一部实验用鱼质量控制标准(DB11 /T 1053-2013)包括了：养殖水中微生物学等级及监测[15]、养殖水中寄生虫学等级及监测、遗传质量控制[16]、配合饲料技术要求、饲养环境条件和病理诊断规范”六个部分。但标准中未涉及到碘含量，而根据本实验结果，缺乏碘会导致斑马鱼甲状腺肿大，威胁到斑马鱼健康，所以在饲养斑马鱼时需使用有碘盐，以保证斑马鱼健康。

(感谢洪晓黎、张璐文、王贝贝、谢恩军、刘丽、何旭艳、尹文林、潘鲁湲等在课题开展过程中给予的指导和帮助。)