不同浓度含铬垫料对小鼠血液学及脏器的毒性观察

贾欢欢, 曾业文, 罗 挺, 龚宝勇, 麦冬梅, 潘迎春, 赵维波

(广东省实验动物监测所, 广东省实验动物重点实验室, 广州 510663)

垫料是实验动物长期接触的物质，可通过皮肤、呼吸道、消化道等途径进入动物体内，垫料质量的优劣与实验动物质量密切相关。近年来，北京、江苏及河北相继出台了关于实验动物垫料的地方标准，内容仅涵盖了性状、水分、微生物、农残及部分重金属，如砷、铅、镉、汞。由于研究数据的缺乏, 导致标准中要求控制的重金属指标相对较少。目前研究[1-4]表明，金属铬的过量摄入会导致机体出现肝肾毒性、免疫毒性、神经毒性、生殖毒性、遗传毒性及致癌性。我们前期对广东省10家单位的垫料进行了抽检[5]，发现垫料中铬的含量在1.2～21.4 mg/kg[81]。鉴于铬可能对实验动物产生一定的毒性反应，本研究拟通过配制含不同浓度六价铬垫料，以BALB/c裸小鼠和KM小鼠为研究对象，分析含铬垫料对小鼠血液学及脏器的毒性反应，以期确定其安全浓度，推进实验动物垫料标准化的建立。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3～4 周龄 SPF 级 BALB/c 裸小鼠 48 只, 雌雄各半, 体质量15～17 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]； 3～4 周龄SPF级KM小鼠48只, 雌雄各半, 体质量15～17 g,购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0002]； 动物饲养于广东省实验动物监测所屏障设施[SYXK(粤)2016-0122]，本试验的动物使用经广东省实验动物监测所IACUC委员会批准(IACUC2017031)，试验过程接受IACUC的监督检查。动物饲养于IVC笼具(长×宽×高为35 cm×14.5 cm×14 cm)，每笼6只，每周更换1次垫料。饲养环境：温度20.0～26.0℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 实验用垫料

玉米芯垫料购自沈阳新鸿腾生物科技有限公司。对垫料中的微生物、重金属(砷、铅、镉、汞、铬)及农药残留进行了检测, 结果符合河北省(DB13/T 2547-2017)和江苏省(DB32/T 2129-2012)关于垫料的地方标准，其中铅、镉、汞未检出，砷为(0.13±0.01) mg/kg，低于上述地方标准要求，铬含量为(2.30±1.12) mg/kg。

1.3 实验试剂和仪器

重铬酸钾购自天津市大茂化学试剂厂(AR，规格500 g/瓶，批号P7778-50-9)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒均购自广州科方。血细胞分析仪(Sysmex XT-2000iv, 日本)，血生化分析仪(日立7020, 日本)，EG1150H+C石蜡包埋机、RM2255轮转切片机、DM2500生物显微镜均购自德国Leica。

1.4 方法

1.4.1 含铬垫料的制备 配制不同浓度的重铬酸钾水溶液，1 kg垫料浸泡于3 L不同浓度的重铬酸钾溶液中, 室温条件下浸泡24h, 过滤后自然晾干, 经高压灭菌后提供动物使用, 于每次更换垫料前一天制备。依据国家标准GB/T 13088-2006/3中火焰原子吸收光谱法进行垫料中铬含量的测定。测定结果发现，5 mg/100 mL、15 mg/100 mL和60 mg/100 mL重铬酸钾溶液浸泡空白垫料24 h，高压灭菌处理后垫料中铬含量分别为(15.50±0.71) mg/kg、(71.50 ±3.54) mg/kg 和(347.00±35.36) mg/kg。

1.4.2 分组 48只BALB/c裸小鼠及48只KM小鼠分别根据体重随机分为4组，每组动物12只，雌雄各半。4组分别为对照组[垫料中含铬2.30±1.12 mg/kg]、低剂量组[垫料中含铬15.50±0.71 mg/kg]、中剂量组[垫料中含铬71.50±3.54 mg/kg]、高剂量组[垫料中含铬347.00±35.36 mg/kg]，2种小鼠均分别饲养于不同铬含量的垫料中15周，每周更换1次垫料。

1.4.3 动物一般观察 每日观察动物的一般状态,包括行为活动、被毛、呼吸、饮食、反应等。

1.4.4 动物血常规检查 试验结束前1 d动物禁食不禁水过夜，动物麻醉后眼眶采血，EDTA2Na抗凝采血，采集后立即上下颠倒混匀，1 h内上机测定，使用小鼠血常规模块进行分析。

1.4.5 血液生化检测 试验结束时，动物眼眶采血，血液不抗凝，在室温下放置 30～50 min 后，3 500 r/min离心10 min，取血清，生化分析仪检测生化相关指标，包括ALT、ALP、Crea、Urea、TBIL、DBIL、ALB、Urea、TCHO、TG、HDL-C、LDL-C等。

1.4.6 大体解剖观察 所有动物都经大体解剖检查，记录每只动物的大体病理学变化。

1.4.7 脏器系数检测 试验结束时，取心、肝、脾、肺、肾、脑、卵巢、子宫等脏器称重，并计算脏器系数，脏器系数=脏器重量/动物体质量×100%。

1.4.8 病理学检查 试验结束时，取大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺残基、腹侧皮肤、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠组织等组织进行病理学检查。脏器固定于体积分数10 %甲醛固定液，经脱水、浸蜡、包埋、切片等程序行HE染色，镜检。

1.4.9 统计学方法 所得数据采用SPSS 24.0统计软件，实验结果采用±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般观察

BALB/c裸小鼠及KM小鼠分别饲养于不同含量铬垫料中15周，均未出现动物死亡，且试验期间动物精神状态良好，体格健壮，饮食及反应均正常。

2.2 动物血常规

BALB/c裸小鼠及KM小鼠分别饲养于不同铬含量垫料中15周，与对照组比较，2种小鼠外周血血常规各项指标差异无统计学意义(P＞0.05)，且各剂量组间比较差异也无统计学意义(P＞0.05)(表 1，2)。

2.3 动物血液生化

与对照组比较，低、中、高剂量组血清中ALT及 BUN水平均显著升高(P＜0.05), 中、高剂量组血清中ALP、Crea水平均显著升高(P＜0.05),低、高剂量组血清中TG水平显著下降(P＜0.05)，其他血液生化指标差异无统计学意义(P＞0.05)； KM小鼠饲养于不同铬含量垫料中15周，与对照组比较, 各剂量组血液生化指标差异无显著性(P＞0.05),各指标低、中、高剂量组间比较差异无显著性(P＞0.05)(表 3，表 4)。

表1 不同铬含量垫料中饲养15周BALB/c裸小鼠血常规指标

表2 不同铬含量垫料中饲养15周KM小鼠血常规指标

表3 不同铬含量垫料中饲养15周BALB/c裸小鼠血生化指标

表4 不同铬含量垫料中饲养15周KM小鼠血生化指标

2.4 大体解剖

BALB/c裸小鼠及KM小鼠饲养于不同铬含量垫料中15周，各剂量组小鼠解剖后，大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺残基、腹侧皮肤、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠组织与对照组比较，其脏器位置、大小、形状、硬度、外观颜色未见明显异常改变，均未见明显渗出、增生、水肿、萎缩等病变。

2.5 动物脏器系数

BALB/c裸小鼠及KM小鼠饲养于不同铬含量垫料中15周，2种小鼠各组间不同脏器系数比较差异无统计学意义(P＞0.05)(表5，6)。

2.6 组织病理学

组织病理学检查发现，BALB/c裸小鼠及KM小鼠经不同铬含量垫料饲养15周，2种小鼠肝、肾、睾丸及卵巢均表现出不同程度的病理学改变。大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、脾脏、肺脏、胸腺残基、腹侧皮肤、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、附睾、子宫等镜下结构正常，未见明显的病理学改变。

BALB/c裸小鼠病理学改变： 对照组动物肝、肾、睾丸及卵巢病理学检查未见异常； 低、中、高剂量组部分动物出现肝脏局灶性炎细胞浸润(低剂量组3例, 中剂量组4例, 高剂量组8例), 肝细胞水肿(低剂量组4例, 中剂量组8例, 高剂量组10例),肾脏炎细胞浸润(低剂量组5例, 中剂量组7例, 高剂量组10例), 睾丸曲细精管萎缩(低剂量组3例,中剂量组3例, 高剂量组3例), 黄体减少(低剂量组1例, 中剂量组2例, 高剂量组4例)(图1)。

表5 不同铬含量垫料中饲养15周BALB/c裸小鼠脏器系数

表6 不同铬含量垫料中饲养15周KM小鼠脏器系数

图1 不同含铬垫料饲养15周BALB/c裸小鼠部分脏器病理变化

KM小鼠病理学改变： 对照组动物肝、肾、睾丸及卵巢病理学检查未见异常； 低、中、高剂量组部分动物出现肝脏局灶性肝细胞水肿(低剂量组2例，中剂量组2例，高剂量组4例)，肾脏肾小管透明管型(对照组3例, 低剂量组4例, 中剂量组1例，高剂量组1例)应为自发性病变, 肾脏炎细胞浸润(低剂量组4例, 中剂量组11例, 高剂量组7例), 睾丸曲细精管萎缩(低剂量组2例, 中剂量组2例, 高剂量组1例), 卵巢中、高剂量组黄体数量减少(中剂量组2例, 高剂量组3例)(图2)。

图2 不同含铬垫料饲养15周KM小鼠部分脏器病理学观察

3 讨论

铬是机体不可或缺的微量元素，铬的缺乏会引起糖、脂、核酸及蛋白质代谢的紊乱[6-9], 而过量铬的摄入可导致肝肾毒性、免疫毒性、神经毒性、生殖毒性、遗传毒性和致癌性[1-4]。自然界铬以零价、三价和六价的形式存在, 目前研究[4]表明三价铬不易进入细胞内因而毒性较小，六价铬易于进入细胞内且在代谢的过程中产生毒性较大的中间产物，因而六价铬具有较强的生物毒性，因此本研究选择重铬酸钾(六价铬)浸泡垫料。

本文研究结果显示，同含铬垫料中饲养BALB/c裸小鼠15周，可导致小鼠肝功能指标ALT和ALP升高，TG下降，其中ALT和ALP反映炎症的活动程度，是诊断中毒性肝炎及肝细胞损伤的的重要指标, 而TG是肝功能下降的特异性指标。此外, BALB/c裸小鼠各剂量组BUN及Crea水平也有不同程度的升高，这2个指标直接反映肾脏炎症。病理检查发现，BALB/c裸小鼠各剂量组出现肝肾炎细胞浸润、肝细胞水肿等改变，病理学改变与血生化指标的变化相一致。付婧等[10]连续灌胃小鼠1个月重铬酸钾溶液后小鼠活动减少，精神状态变差，病理检查出现明显的肝肾损伤。考庆君等[11]研究表明雌性Wistar大鼠经口灌胃摄入31.6 mg/kg剂量和雄性摄入21.5 mg/kg剂量的重铬酸钾90 d均可导致外周血ALT、Crea、BUN升高，肝窦扩张、淤血及肝细胞坏死等病理改变。此外不同剂量组BALB/c裸小鼠出现睾丸曲细精管萎缩、卵巢黄体减少等病理学改变，此结果与文献报道一致，王亚东等[12]研究表明六价铬对雄性动物性腺、精子形态、性功能和生育能力均有一定的影响，Pereira 等[13]研究发现腹腔注射六价铬可导致大鼠睾丸、精囊及包皮腺重量明显下降。李紫等[14]研究认为六价铬可导致雄性动物睾丸组织器质性损害，严重影响小鼠睾丸的正常发育。

应用不同含量的铬垫料饲养KM小鼠15周，血常规、血生化等指标未见明显改变，而病理学检查表现出与BALB/c裸小鼠相似的改变，如肝细胞水肿、肾脏炎性细胞浸润、睾丸曲细精管萎缩、卵巢黄体减少等，但出现病变的动物数量低于BALB/c裸小鼠。与KM小鼠相比，BALB/c裸小鼠无毛，皮肤可直接接触垫料，导致体内摄入的铬含量高于KM小鼠，且KM小鼠免疫能力明显优于BALB/c裸小鼠，这些原因可能是导致BALB/c裸小鼠与KM小鼠毒性反应程度不同的原因。此外KM小鼠包括对照组在内的动物均出现了肾脏肾小管透明管型，考虑为其他因素导致的病理改变。

综上所述，垫料中六价铬含量达到(15.50±0.71) mg/kg及以上时可导致BALB/c裸小鼠及KM小鼠出现不同程度的肝、肾、睾丸及卵巢的毒性, 这将有助于推进实验动物垫料的标准化建立。