裸鼹鼠抗化学诱癌因素特性的研究

陈 超, 丛 薇, 杨文静, 崔淑芳

(海军军医大学基础医学院实验动物学教研室, 上海 200433)

裸鼹鼠对癌症具有天然抗性，无论是野生的裸鼹鼠还是人工饲养的裸鼹鼠，其肿瘤发生率都极低，仅极少数20岁以上的裸鼹鼠发生自发性肿瘤[1]。裸鼹鼠对癌症的超强免疫力，极有可能为人类攻克癌症这一医学难题提供重要线索。此外，其抗肿瘤机制备受关注，甚至一度成为顶尖学术杂志《Nature》的封面主角[2]。因此，对裸鼹鼠生物学特性的研究受到广泛关注，其抗肿瘤等特性有望为相关疾病的研究和药物研发提供新的动物模型材料和研究策略[3]。目前，肿瘤已经成为威胁人类健康的第一杀手[4]，而肺癌是发病率、病死率居首的恶性肿瘤，患者总的5年生存率不到15%，在我国则更低[5]。乌拉坦(urethane)又名氨基甲酸乙酯，常用于肺癌疾病动物模型的建立，借助乌拉坦对肺癌的发病机理进行研究及对肺癌治疗药物筛选已成为目前非常重要的研究手段。世界卫生组织下属国际癌症研究中心于2007年将其划分为2A级致癌物。亚胺基偶氮甲苯(OAAT)被广泛应用于染料制造及医药行业，其中的苯环与胺基的氮原子相连接，分子比较活跃，进入人体后会破坏正常细胞中DNA，引起人体病变[6]。同时，OAAT在还原条件下不稳定，会进一步分解成邻甲苯胺，邻甲苯胺具有高毒性和致癌性，是环境污染的重要物质[7]。本研究使用以上2种常用的化学致癌剂作为肿瘤诱导剂，分别对裸鼹鼠和常用实验小鼠进行致病诱导，观察2组动物的生存及病理变化，可以直观、系统地观察裸鼹鼠抗化学药物致癌的现象，为进一步研究其抗癌机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

52周龄普通级封闭群雄性裸鼹鼠, 由本实验室自行繁殖饲养(第6世代)； 8周龄SPF级雄性ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠, 购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2013-016]。动物均饲养在屏障设施[SYXK(沪)2017-0004]。

1.2 主要仪器与试剂

光学显微镜购自德国Leica公司； 全自动血液细胞分析仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司； 乌拉坦、OAAT均购自美国Sigma-Aldrich公司,通用型组织固定液购自武汉谷歌生物科技有限公司,苏木精、伊红染液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乌拉坦对裸鼹鼠的影响 乌拉坦诱导裸鼹鼠组、ICR小鼠组、C57BL/6J小鼠组和BALB/c小鼠组每组各20只，均为雄性。 参照乌拉坦诱导小鼠肺癌模型制备方法，配制10%乌拉坦生理盐水溶液(10 g/100 mL)[8]。每只动物每次按每克体质量0.01 mL乌拉坦溶液的剂量进行腹腔注射，每周注射2次，持续3个月。每月每组处死4只动物观察肿瘤发生情况，每月对动物的体质量进行记录，停药后每月进行外周血白细胞计数。实验期间动物若发生死亡则对其进行解剖，观察肺部情况，并计入每月处死动物数中。诱导结束后2个月，采用安死术处死所有未死亡动物，进行解剖并观察肺部情况。

1.3.2 OAAT对裸鼹鼠的影响 OAAT诱导裸鼹鼠组、ICR小鼠组、C57BL/6J小鼠组和BALB/c小鼠组每组各10只，均为雄性。将1% OAAT溶液分别涂抹于裸鼹鼠和小鼠两肩胛间皮肤上(每周对涂药部位进行一次剃毛)，隔日1次，每次2～3滴。3个月后采用安死术处死动物，观察胸腺、脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结、骨髓等组织脏器变化情况，并进行组织切片染色观察。

1.4 数据统计学处理

2 结果

2.1 乌拉坦对裸鼹鼠的影响

小鼠在乌拉坦诱导3个月后开始发生肺肿瘤，诱导结束后2个月肺部肿瘤平均发生率大于50%，而裸鼹鼠在乌拉坦诱导结束后2个月仍然未见肿瘤发生(图1、表1)； 小鼠平均体质量总体呈下降趋势，而裸鼹鼠体质量无显著下降(表2)；小鼠外周血中淋巴细胞、中性粒细胞及单核细胞等白细胞的含量显著下降，而裸鼹鼠外周血白细胞计数无显著变化(表3)。

表1 乌拉坦诱导后动物成瘤率

2.2 OAAT对裸鼹鼠的影响

OAAT诱导3个月，病理检查见小鼠肝窦中椭圆细胞广泛增生，肝细胞广泛肿胀，部分肝细胞发生点状脂肪变性，细胞内充满小而密的脂滴。胸腺组织中散布有多量吞噬有蓝色颗粒状细胞碎片的巨噬细胞，血管轻度扩张，且充满红细胞。红髓脾窦中大量含铁血黄素沉积，白髓散布较多吞噬有细胞碎片和含铁血黄素的巨噬细胞。肠黏膜绒毛固有层有少量浆细胞浸润。骨髓腔靠近关节位置，造血组织减少、缺失，被脂肪组织取代。裸鼹鼠各个器官组织病理切片未见明显病变，其中裸鼹鼠的胸腺已基本退化，故病理图中无裸鼹鼠胸腺染色图(图2)。

表2 乌拉坦诱导后动物体质量 g

表3 乌拉坦诱导后动物白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞计数 ×109/L

图1 乌拉坦诱导结束后2个月不同动物肺脏大体观察

图2 OAAT处理动物组织病理学观察(HE×400)

3 讨论

裸鼹鼠本身具有较强的抗肿瘤特性[9]，以裸鼹鼠为模型研究其抗肿瘤机制的报道屡见不鲜。研究[10]发现，裸鼹鼠的成纤维细胞对接触抑制非常敏感，这种细胞间“早期接触抑制”能力可有效防止肿瘤细胞的过量增殖。进一步研究[2]发现，裸鼹鼠细胞和组织产生的大量高分子量透明质酸在参与细胞间接触抑制过程中起到关键作用。同时，裸鼹鼠细胞对山中因子(Yamanaka factors)重编程具有很高的抵抗力，诱导多能干细胞(IPCS)克隆率极低，这种现象可以通过失活视网膜母细胞瘤蛋白(Rb蛋白)来逆转，并且裸鼹鼠IPCS体内畸胎瘤形成率比小鼠低得多，经组蛋白比较，发现裸鼹鼠染色质在启动子区域具有更紧密得结构，裸鼹鼠细胞具有更稳定的表观基因组[11]。另外，还有文章[12,13]报道裸鼹鼠特异性单氨基酸变化、高保真蛋白质合成、活跃的抗氧化反应途径、通过自噬和蛋白质酶体更活跃的蛋白水解均可能有助于裸鼹鼠抗癌性。这些研究报道说明以裸鼹鼠为模型研究其抗肿瘤机制，将为肿瘤的防治提供重要借鉴。本研究通过对裸鼹鼠和常用实验小鼠进行化学致癌因素诱导的研究，发现裸鼹鼠对于致癌化学因子具有天然的抗性，其生活状态、生化指标、组织器官的形态与功能都未因外部化学药物刺激而发生明显改变。虽然关于裸鼹鼠的类似研究已有报道，但使用的均是模拟野生环境和真社会性生活饲养繁育的裸鼹鼠。本实验使用的裸鼹鼠为通过实验动物标准化饲养后生产的裸鼹鼠，本研究结果证明这些裸鼹鼠具有与野生裸鼹鼠同样天然的、良好的抗肿瘤特性。

同时，免疫系统与机体肿瘤的发生与发展有着密不可分的联系[14]。在本实验室前期对裸鼹鼠固有免疫反应的研究中，发现其以巨噬细胞的免疫应答为主[15]。而通过单独或联合阻断整合素相关蛋白(CD47)分子，可以释放巨噬细胞的抗肿瘤能力[16-19]。这可能是裸鼹鼠对化学致癌因素产生抗性的原因之一。