不同方法制备鳀鱼鱼露风味物质比较

王炳华，严利强，胡建国

(1.浙江商业职业技术学院 旅游烹饪学院，杭州 310053;2.浙江旅游职业学院，杭州 311231；3.济南大学，济南 250002)

鱼露，又称鱼酱油、胰油，胶东称为鱼汤，福建称为虾油，是一种咸鲜味的调味品，目前广泛应用于中餐烹饪[1]。主要是利用一些低值杂鱼、虾或渔业生产下脚料为原材料，通过微生物发酵，分解原料中的脂肪、蛋白质等成分，酿造而成的调味品，其色泽棕红、咸鲜适口，在中餐烹饪中起到增鲜祛异的作用[2]。鱼露中富含18种以上的氨基酸、多种有机酸和人体代谢必需的微量元素，营养价值较高[3]。

目前鱼露的加工主要以天然发酵、低盐发酵、内脏发酵、外加种曲发酵和复合发酵为主。传统天然发酵具有发酵周期长(一般周期为1年，发酵周期长的可以达2～3年)、含盐量高的特点，但是其风味独特；低盐发酵通过降低盐含量，控制发酵温度，实现缩短发酵周期的目的。晁岱秀等[4]以鳀鱼为原料，采用低盐发酵制作潮汕鱼露，成品的TSN、氨基酸态氮以及氨基酸质量浓度相对传统工艺有大幅提高。内脏发酵主要依靠添加富含酶的鱼内脏，促进蛋白质快速水解，缩短发酵周期。曲映红等[5]采用智利外海茎柔鱼内脏为原料，制备的鱼露品质优于加酶发酵的样品。加曲发酵通过添加适宜的菌种，在发酵过程中分泌酶类物质，加速蛋白质水解，缩短发酵周期。陶忠[6]通过接种酱油曲发酵蓝圆鲹制备鱼露，成品的鱼腥味和胺味弱,游离氨基酸含量上升。复合发酵主要是将常见方法结合，如赵久香[7]采用低盐发酵与接种曲种结合方式制备鱼露，成品的品质优良。方忠兴[8]通过低盐发酵，并添加虾头等下脚料速酿鱼露，缩短发酵周期至80 d，改善了鱼露风味。目前对鱼露的研究主要以品质改良为主，对于其风味物质的研究相对较少。

鳀鱼是我国黄海、东海单种鱼类资源生物量最大的鱼种，价格低廉，可开发利用空间较大[9]。本研究以鳀鱼为原料，采用传统发酵法、低盐发酵法、两段发酵法和复合发酵法制备鱼露，通过感官品质、挥发性成分、游离氨基酸、呈味核苷酸等指标来分析不同发酵方式对鱼露风味物质的影响，为相关研究提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鳀鱼：购于舟山渔港，选择体长均匀，单体重量在20 g的鳀鱼，置于密封冷藏箱运至实验室，冷冻备用；食盐：市售；米曲霉3.042、木瓜蛋白酶：购于浙江汇宁生物科技有限公司；麸皮、豆粕：市售；甲醇、乙腈：均为色谱纯；其他试剂：均为国产分析纯。

BT-456A电子天平 深圳市博途电子科技有限公司；HH-501恒温水浴锅 常州市金坛高科仪器厂；HH-X7多功能料理机 茂名市永思达电器有限公司；DHP-9010D电热恒温培养箱 安庆洁佳仪器设备有限公司；GCMS-2010S GC-MS 联用仪 上海硅仪生化科技有限公司；G1530N氨基酸分析仪 昆山市赛特科学仪器有限公司；K1100/F自动凯氏定氮仪 广州市鸿洲实验器材科技有限公司；PHS-25-01台式酸度计 衢州艾普计量仪器有限公司；H-5424台式高速离心机 北京博远科技公司；FJ-200高速分散均质机 广州市正恒自动化设备有限公司。

1.2 实验设计

本实验分别采用传统发酵法、低盐发酵法和复合发酵法制备鳀鱼鱼露，各种方法的制备工艺如下。

1.2.1 传统发酵法

将冷冻鳀鱼解冻，整条从中间对切，并用蒸馏水漂洗干净，加入30%的盐拌匀，放入器皿中，在自然温度下发酵14个月，发酵期间每3 d搅拌一次，将发酵成品搅拌均匀，过滤，制得鱼露，将鱼露在100 ℃杀菌10 min后放入冰箱(4±1) ℃冷藏备用。传统发酵法鱼露从舟山市普陀区天地鱼露厂购买。

1.2.2 低盐发酵法

参考周崇禅[10]的方法。

1.2.2.1 曲液制备

将米曲霉3.042接种于豆粕培养基中，在32 ℃环境下培养5 d，加入麸皮100 g、面粉30 g和水150 mL，继续培养24 h，豆粕大曲制备完成。

1.2.2.2 原料处理

将冷冻鳀鱼解冻并清洗干净，沸水蒸30 min，放入多功能料理机搅打成浆。

1.2.2.3 接种发酵工艺

在鱼肉中加入5倍的水，拌匀，加入胰蛋白酶2%，在50 ℃温度下酶解6 h，再加入木瓜蛋白酶1.5%，继续酶解3 h，酶解后通过水浴灭酶15 min，水浴温度100 ℃。待冷却至室温后加入豆粕大曲2%、食盐9%，搅拌均匀后放入恒温培养箱内，在33 ℃条件下发酵25 d，发酵期间每3 d搅拌一次。将发酵成品搅拌均匀，过滤，100 ℃杀菌10 min，放入冰箱(4±1) ℃冷藏备用。

1.2.3 复合发酵法

参考张豪[11]的方法，采用前期外加曲液发酵与后期微生物发酵结合，曲液制备与原料处理同1.2.2。

1.2.3.1 前期外加曲液发酵

将处理好的鱼肉加入曲液12%、盐13%，在35 ℃环境下发酵18 d，发酵期间每3 d搅拌一次。

1.2.3.2 后期微生物发酵

在经过前期发酵的鱼肉中添加乳酸乳球菌乳亚种(L.lactissubsp.lactis)6%，在38 ℃环境下发酵6 d，发酵期间每3 d搅拌一次，此阶段为有机酸发酵阶段；再加入球形球拟酵母10%，在32 ℃环境下发酵3 d，此阶段主要是产脂产香，将发酵成品搅拌均匀，过滤，100 ℃杀菌10 min，放入冰箱(4±1) ℃冷藏备用。

1.2.4 样品处理

传统发酵法制备的鱼露含水量为(65.19±1.63)%，低盐发酵法制备的鱼露含水量为(81.41±0.83)%，复合发酵法制备的鱼露含水量为(75.91±2.09)%。3种发酵方式制备的鱼露含水量差异较大，要将其稀释为相同含水量后进行风味物质比较，以含水量最高的低盐发酵法制备的鱼露含水量为标准，传统发酵法与复合发酵法两种方法稀释至含水量为81.41%。

1.3 指标测定

1.3.1 理化指标检测

总氮的测定依据国家标准GB/T 609-2018《化学试剂总氮量测定通用方法》；氨基酸态氮的测定参考熊文飞等[12]的方法；短肽的测定参考朱瀛等[13]的方法；TVB-N的测定参考李锐等[14]的方法；pH值的测定参考胡肇烜等[15]的方法。

1.3.2 感官评价

3种发酵方法制备的鱼露感官评定方法采用5分制，分别从鲜味、腥异味、咸味、回味感、醇厚度、酸味6个指标进行评价，每个指标总分5分，每项评分去掉最高分与最低分取平均分。感官评定人员由16人组成，均具有食品专业背景，男女各半，年龄在18～22岁，在感官评定前针对鱼露感官评价特点进行培训，并禁烟酒以及刺激性食物24 h[16]。具体评价标准见表1。

表1 感官评定标准Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.3 鱼露挥发性风味物质测定

参考肖宏艳等[17]与王悦齐等[18]的方法，采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)。

GC-MS检测条件：色谱柱为毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；起始温度为50 ℃，以5 ℃/min的速率升温至230 ℃，检测温度为240 ℃，载气为氦气，载气流速为1.5 mL/min；电离方式：EI，电子能量：70 eV，质量扫描范围：35～245 amu。

1.3.4 鱼露游离氨基酸含量测定

参考张慧林等[19]与李锐等[20]的方法，按照GB/T 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》进行测定。

1.4 数据分析

样品测定3次，使用Origin 8.0和Excel 2010 软件进行数据统计分析与制图。

2 结果与分析

2.1 不同方法制备鱼露理化指标检测结果

表2 鱼露理化指标检测结果Table 2 Test results of physicochemical indicators of fish sauce

3种方法制备的鱼露中总氮、氨基酸态氮、短肽、TVB-N和pH值是影响成品风味的重要指标。总氮主要是蛋白质类氮以及非蛋白质类氮分解的产物，由表2可知，3种方法制备的鱼露总氮含量均达到鱼露品质的一级标准。其中传统发酵法总氮含量最高，其次为复合发酵法与低盐发酵法；氨基酸态氮含量直接影响鱼露的醇厚感和回味感等，含量越高，其风味品质越佳，检测结果发现传统发酵法氨基酸态氮含量为1.52 g/dL，优于复合发酵法1.38 g/dL，低盐发酵法最低，为1.25 g/dL；复合发酵法与低盐发酵法制备的鱼露中短肽含量均高于传统发酵法，复合发酵法短肽含量最高，达到了2.11 g/dL，主要是其添加了曲液与微生物，能有效地分解蛋白质，起到了快速发酵的作用；复合发酵法与低盐发酵法制备的鱼露中TVB-N低于传统发酵方式，说明添加曲液与微生物在一定程度上能抑制腐败微生物的繁殖；pH值偏高说明发酵过程中细菌繁殖较快，影响成品鱼露的风味，3种发酵方式制备的鱼露pH值相差不显著，对风味影响不大。

综合分析，传统发酵法总氮、氨基酸态氮含量较高，其成品风味物质含量丰富；添加曲液与微生物起到了快速发酵的作用，对腐败微生物繁殖有一定的抑制作用；3种方法制备的鱼露pH值相差不显著。

2.2 不同方法制备鱼露感官评价结果分析

本研究3种发酵方法制备的鱼露，通过鲜味、腥异味、咸味、回味感、醇厚度、酸味6个指标来评价其感官特征。咸鲜味是鱼露的主体味道，其主要是由鲜味物质与咸味物质协同呈现，某一种味道浓度差异都会影响其呈味效果。鱼露中的鲜味物质主要来源于发酵过程中的氨基酸和某些甜味物质，咸味主要受盐的添加量的影响。其他异味来源主要是在发酵过程中未完全分解的氨类物质或发酵不彻底等因素。

由图1可知，各指标评分均较高，说明3种发酵方式制备的鱼露感官品质均良好。传统发酵方式制备的鱼露在鲜味与醇厚度两个指标上优于另外两种方法制备的鱼露，主要是因为其发酵时间长，蛋白质分解程度较高，利于风味物质形成；传统发酵方式制备的鱼露在腥异味与咸味两个指标上低于另外两种方法，主要是由于传统发酵方式盐添加量较高，抑制鱼自身蛋白酶活性，某些腥味物质分解不彻底。低盐发酵方式在发酵过程中控制了盐的添加量，通过外加曲液加速发酵过程，其咸味指标低于传统发酵方式和复合发酵方式制备的鱼露，但其在回味感、醇厚度、酸味和咸味等方面表现较差，主要是由于其发酵周期短，不利于风味物质产生。复合发酵方式采用外加曲液发酵与微生物发酵结合的方式，其腥异味和酸味指标评分较高，主要是微生物加速了蛋白质分解，抑制了腥异味产生，降低了酸度。综上所述，传统发酵方式制备的鱼露整体风味最佳，其次是复合发酵方式与低盐发酵方式制备的鱼露。

图1 感官评价结果Fig.1 Sensory evaluation results

2.3 不同方法制备的鱼露主要挥发性成分比较

表3 鱼露主要挥发性成分测定结果Table 3 Determination results of main volatile components in fish sauce

续 表

鱼肉在制备鱼露的过程中，其挥发性风味物质主要是通过以下途径形成：蛋白质通过自身蛋白酶以及难盐微生物作用下被分解成氨基酸及其他含氮化合物，部分氨基酸进一步分解成挥发性脂肪酸[21]；不饱和脂肪酸和游离脂肪酸在酶的作用下或被自动降解形成挥发性醇、酮类物质。3种发酵方式在发酵过程中，发酵时间与发酵手段的差异导致挥发性风味物质的差异。由表3可知，从3种不同发酵方式制备的鱼露中共检测出29种风味物质，其中酸类6种、醇类5种、醛、酮类7种、酯类3种、含氮化合物5种、其他类3种。其中传统发酵方法检测出26种、低盐发酵法检测出19种、复合发酵法检测出21种。

酸类化合物主要是甘油三酯被水解生产，阈值较高，对不同发酵方式制备的鱼露挥发性风味贡献不大[22]。对比3种发酵方式，传统发酵方式因发酵时间长，酸类物质含量相对较高；低盐发酵方式酸类物质含量最少，主要受发酵时间与添加曲种发酵程度的影响。

醇类化合物主要来源于脂肪氧化和氨基酸等物质代谢，阈值较低，在鱼露挥发性成分中贡献率较高[23]。3种发酵方式制备的鱼露均含有醇类，传统发酵方式除不含2-甲基-1-丙醇，含有全部被检测出的醇类物质，复合发酵法未检出苯乙醇与2-甲基-1-丙醇外，低盐发酵法未检测出苯乙醇。醇类化合物的种类与含量是影响鱼露香气风味的关键因素，其种类越丰富，含量越高，整体品质越佳。

醛、酮类是脂质氧化的产物，能产生青草、麦芽、水果等令人愉悦的气味。其中庚醛具有鱼腥味，是鱼露中呈现腥味的主要成分，对比3种发酵方式，传统发酵方式其含量最高，其次为低盐发酵、复合发酵。主要是传统发酵方式受发酵程度影响，对醛、酮类物质分解能力较弱，低盐发酵与复合发酵因添加曲种与微生物，有利于降低鱼露中糠醛的含量，降低腥味。

酯类主要是受鱼露发酵过程中醇类物质和酸类物质酯化反应程度的影响。酯类物质主要呈现花香、果香味道，浓度较低，增加鱼露的醇厚感。传统发酵方式制备的鱼露酯类物质种类和含量均优于复合发酵方式与低盐发酵方式。

另外，还检测出含氮化合物以及正十二烷、十三烷等物质成分。含氮化合物主要是炙烤味和氨味的来源，三甲胺呈现鱼腥味。含氮化合物和其他物质成分对鱼露的整体风味有负面影响，但是因其阈值较高，不容易被感受到。

其他呈现坚果味、草香、青豆香、鱼香等物质可增加鱼露的回味感。

综合分析，传统发酵方式制备的鱼露的挥发性风味物质的种类和含量最多，其风味效果最佳，其次是复合发酵方式与低盐发酵方式制备的鱼露，这一结果与感官评价结果一致。

2.4 不同方法制备的鱼露游离氨基酸含量

游离氨基酸是构成不同发酵方式制备的鱼露风味物质中重要的鲜味物质，可以与其他风味物质协同，改善整体风味，还是营养价值的主要指标[24]。在鱼露中，游离氨基酸的呈味效果与其含量和阈值有关。鱼露风味以咸鲜味为主，游离氨基酸中呈甜味和鲜味的氨基酸对鱼露风味的影响较大。

表4 鱼露主要游离氨基酸测定结果Table 4 Determination results of main free amino acids in fish sauce mg/dL

由表4可知，3种发酵方式氨基酸总量最高的为传统发酵法制备的鱼露，达到4799.15 mg/dL，其次为复合发酵法制备的鱼露，达到4445.36 mg/dL，最低的为低盐发酵法，含量为4081.33 mg/dL，复合发酵法制备的鱼露中必需氨基酸含量最高，其次为传统发酵法和低盐发酵法；传统发酵法中的鲜味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸与甜味氨基酸甘氨酸、丙氨酸含量比例较高，这是其感官评价较高的主要原因；3种发酵方式苦味氨基酸比例均较高，这影响鲜味的表达，但是少量苦味氨基酸可与其他呈味物质互补，协调滋味，增强醇厚感与回味感；综上分析，传统发酵方式与复合发酵方式发酵时间较长，发酵程度较高，利于呈鲜味、甜味氨基酸的积累，减少苦味氨基酸含量，能形成咸鲜适口、回味醇厚的口味；低盐发酵方式添加曲种，利于蛋白质的水解，但是苦味氨基酸含量略高，对鱼露风味有一点儿影响。

3 结果与讨论

风味物质的种类与含量直接影响鱼露的质量。本文通过对传统发酵法、低盐发酵法和复合发酵法生产的鳀鱼鱼露中风味物质进行对比分析，研究结果表明：3种发酵方式制备的鱼露风味以咸鲜味为主，传统发酵法制备的鱼露中总氮、氨基酸态氮、挥发性风味物质、氨基酸等含量最多，其风味醇厚，回味悠长，品质最佳；3种发酵法制备的鱼露品质均达到了一级标准，复合发酵法和低盐发酵法在醇厚度和回味方面略差于传统发酵法，但是添加曲液与微生物起到了快速发酵的作用，对腐败微生物繁殖有一定的抑制作用；传统发酵方式与复合发酵方式发酵时间较长，发酵程度较高，利于呈鲜味、甜味氨基酸的积累，减少苦味氨基酸含量，能形成咸鲜适口、回味醇厚的口味；低盐发酵方式添加曲种，利于蛋白质的水解，但是苦味氨基酸含量略高，对鱼露的风味有一点儿影响。

虽然低盐发酵法与复合发酵法制备的鱼露风味特点不如传统发酵法，但是在减盐、风味化背景下，如何筛选优质曲种和微生物，改良工艺，生产鲜味醇厚、回味悠长的鱼露将成为研究新趋势。