远东拟沙丁鱼低盐风味鱼露的工艺优化及品质分析

何定芬，吴宇，张瑞娟，方旭波,*，杨会成，陈小娥

(1.浙江国际海运职业技术学院，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大学 食品与药学学院，浙江 舟山 316022；3.浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316021)

鱼露，又称鱼酱油，因其含有大量生物活性肽以及氨基酸等物质，可作为膳食中蛋白质的主要来源[1]。传统鱼露发酵过程中，易产生中链醛、支链羧酸、挥发性氮和含硫化合物等令人不愉快的挥发性物质，影响了消费者对鱼露的可接受性[2]。同时，较高的盐浓度使得微生物的生长受到抑制，延长了鱼露的发酵周期(9～12个月，甚至更长)[3]。相比之下，速酿鱼露具有发酵周期短、腥味不明显等优点，但由于发酵时间较短导致风味物质形成不足，风味不如传统工艺[4]。因此，寻找既能缩短发酵时间又能增加鱼露风味的发酵方式，对速酿低盐鱼露的大规模产业化具有深远的影响。

风味微生物因其在发酵过程中能够产生风味物质，可以很好地改善产品的风味。Zheng等[5]采用Psychrobactersp. SP-1生产鱼露，发现在130 d内，鱼露中氨基酸态氮含量和总可溶性氮含量明显增加，其鲜味与肉香味也显著提升。张豪等[6]使用米曲霉作为外加种曲发酵蓝圆鲹制备鱼露，发酵14 d后氨基酸态氮含量和总可溶性氮含量较高，具有固有香味。利用风味微生物发酵生产鱼露，不仅可以缩短鱼露的发酵周期，而且提高了鱼露的风味，是解决鱼露发酵问题的一条重要途径。本课题组前期从鱼蛋白发酵液中分离筛选得到一种能产生良好风味的酵母，经鉴定为长孢洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)，该酵母赋予发酵液玫瑰清香、烘焙坚果香和烤肉类香味等独特风味[7]。

本文利用该风味酵母为发酵剂，以远东拟沙丁鱼酶解液为原料，采用正交试验法对发酵工艺进行优化，制备低盐风味鱼露，并与市售鱼露进行比较，以期为新型风味海鲜调味料的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

长孢洛德酵母：浙江海洋大学水产食品化学实验室自主保存；冷冻远东拟沙丁鱼：平均体长15～18 cm，-20 ℃冰箱冷冻保存，舟山市海利远洋渔业有限公司；动物蛋白水解酶(1×105U/g)：南宁庞博生物工程有限公司；麸皮、豆粕：济南鸿鑫达生物科技有限公司；食盐：中盐上海市盐业有限公司；蔗糖：国药集团化学试剂有限公司；市售鱼露：水妈妈牌泰国鱼露；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

JJ-2组织捣碎机 常州市金坛友联仪器研究所；YXQ-LS-50G压力蒸汽灭菌器 上海科晓科学仪器有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；KDN-102C定氮仪 上海纤检仪器有限公司；LC-6AD高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器) 日本岛津公司；5804R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；6890N-5973I GC-MS联用仪 美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 沙丁鱼蛋白酶解液的制备

参照陈柔霖等的方法并略作修改。使用流水解冻方式将冷冻远东拟沙丁鱼解冻，切碎，置于均质机中均质，按照料液比1∶2、动物蛋白水解酶添加量4000 U/g、自然pH将样品置于50 ℃水浴恒温振荡器中酶解6.5 h。

1.3.2 种曲的制备

鱼露发酵种曲的制备参照李丝丝等[8]的方法并略作修改。将麸皮、豆粕按3∶2的比例加入到500 mL锥形瓶中混合均匀，加入等质量的水浸润2 h，121 ℃灭菌20 min。待冷却至室温后向其中接种0.2%的长孢洛德酵母菌液，混合均匀后于30 ℃下静置通风培养24 h后摇瓶翻曲一次，继续培养48 h后即制成种曲。

1.3.3 风味鱼露发酵工艺

按比例向远东拟沙丁鱼酶解液中加入种曲、蔗糖及食盐，搅拌均匀后将其放置在设定温度下发酵一定时间。将发酵好的发酵液进行离心、过滤、灭菌，即可得到远东拟沙丁鱼低盐风味鱼露。

1.3.4 风味鱼露发酵工艺的单因素试验

以远东拟沙丁鱼酶解液为基料，以氨基酸态氮含量和风味感官值作为评价标准，在前期研究的基础上，研究种曲接种量(2%、4%、6%、8%、10%)、蔗糖添加量(2%、3%、4%、5%、6%)、食盐添加量(4%、6%、8%、10%、12%)、发酵温度(25，30，35，40，45 ℃)以及发酵时间(15，20，25，30，35 d)对远东拟沙丁鱼风味鱼露发酵的影响。固定条件设定为种曲接种量4%、蔗糖添加量3%、食盐添加量6%、发酵温度35 ℃以及发酵时间20 d，每组各做3次平行试验。

1.3.5 风味鱼露发酵工艺正交试验优化

在单因素试验的基础上，选取对发酵结果影响较大的4个因素，以氨基酸态氮含量和风味感官值为指标，进行L9(34)正交试验优化发酵条件。

1.3.6 氨基酸态氮含量的测定

氨基酸态氮含量的测定参照Zhao等[9]的方法并略作修改，采用甲醛滴定法进行测定。量取20 mL鱼露样品与60 mL蒸馏水混合，向其中加入10 mL中性甲醛溶液(37%～40%)，使用0.1 mol/L氢氧化钠滴定至pH 9.2，记录消耗氢氧化钠的含量。

1.3.7 风味感官评价

根据《感官分析 选拔与培训感官分析优选评价员导则》[10]中所述的感官分析优选评价员的选拔与培训方法，筛选由10名经过培训后的食品专业研究生组成感官评价小组。每组发酵液分别量取50 mL于3个250 mL锥形瓶中并随机编号，用保鲜膜密封后置于60 ℃恒温水浴中10 min，采用先闻后尝的方式，测试过程中不允许交流讨论。根据表1所示评分标准[11]对鱼露的风味特性进行独立评价打分，每项满分10分，总分取平均值，分值越大，说明鱼露的风味越好，剔除异常数再求取平均值得到最终结果。

表1 鱼露风味感官标准Table 1 The sensory standard of fish sauce flavor

1.3.8 常规理化指标分析

采用李丝丝等的方法，对风味鱼露与市售鱼露中总氮、总酸、食盐、可溶性无盐固形物、组胺等含量进行检测。氨基酸态氮含量的测定参照上文进行。

1.3.9 氨基酸分析

风味鱼露与市售鱼露中游离氨基酸组成分析采用Ota等[12]的方法并略作修改。使用10 g/dL的三氯乙酸溶液与鱼露按1∶1混合均匀，静置1 h后使用双层滤纸进行过滤，滤液经10000 r/min离心处理，上清液过0.22 μm水膜，放入氨基酸自动分析仪样品盒中，上机测定。

1.3.10 鱼露挥发性风味物质分析

根据Ding等[13]的方法，采用GC-MS对风味鱼露与市售鱼露中挥发性风味物质进行分析。量取5 mL鱼露于20 mL密封的萃取瓶中，40 ℃平衡15 min。将已经过老化的萃取头(75 μm CAR-PDMS纤维)插入样品瓶中，54 ℃萃取60 min，萃取完成后将萃取头直接插入GC进样器中进样5 min。

GC条件：DB-WAX色谱柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始温度40 ℃(保持3 min)，以5 ℃/min的速率升至120 ℃，然后以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min。在不分流进样模式下，载气(He)流速为1.0 mL/min。

MS条件：通过电子碰撞(EI)模式(电离能70 eV；离子源温度200 ℃)执行MS裂解。传输线温度为250 ℃。采用全扫描模式，质量扫描范围为35～550 m/z。

1.4 数据分析

所有分析数据均应用OriginPro 8.5软件进行处理，SPSS 18.0软件的Duncan氏法对试验数据进行显著性分析(p<0.05)，每组3次平行。

2 结果与分析

2.1 风味鱼露发酵工艺优化

2.1.1 种曲接种量对鱼露发酵的影响

种曲接种量对鱼露风味形成的速度有着重要影响。由图1可知，随着种曲接种量的增加，鱼露中氨基酸态氮的含量随之上升并最终趋于平衡。当种曲接种量超过4%时，氨基酸态氮含量差异性不显著(p>0.05)，这一趋势与白政泽等[14]的研究结果相似。同样由图1可知，鱼露的风味感官值随着种曲接种量的增加呈先上升后下降的趋势，当种曲接种量达到6%时，风味感官值最高，但与4%时的风味感官值差异不显著(p>0.05)。当种曲接种量超过6%时，鱼露风味下降，说明种曲接种量过高时，种曲自身的代谢物对鱼露的风味品质产生了影响。综合不同种曲接种量对鱼露中氨基酸态氮含量和风味感官值的影响，并考虑成本因素，可以确定风味鱼露发酵种曲接种量为4%时较为适宜。

图1 种曲接种量对鱼露发酵的影响Fig.1 Effect of koji inoculation amount on fish sauce fermentation注：不同大写字母表示氨基酸态氮含量差异显著(p<0.05)；不同小写字母表示感官评分值差异显著(p<0.05)，下图同。

2.1.2 蔗糖添加量对鱼露发酵的影响

在鱼露发酵过程中，碳源不仅为微生物代谢提供主要能量，对鱼露的感官也具有一定的影响。由图2可知，不同蔗糖添加量下氨基酸态氮含量和风味感官值差异性显著(p<0.05)。随着蔗糖的增加，鱼露中氨基酸态氮含量呈先上升后下降的趋势，并且在蔗糖添加量为3%时达到最高。这是由于蔗糖浓度过低，微生物代谢能量不足，影响了微生物的代谢；蔗糖浓度过高，导致鱼露中的渗透压升高，微生物及酶的活性受到影响[15]。同样随着蔗糖含量的增加，鱼露的风味感官值也呈先上升后下降的趋势，并且在3%时风味感官值最高。可能是由于微生物代谢受到抑制，风味物质的产生受到影响。综合以上分析可以看出，长孢洛德酵母发酵生产风味鱼露时的蔗糖添加量为3%时较为适宜。

图2 蔗糖添加量对鱼露发酵的影响Fig.2 Effect of sucrose addition amount on fish sauce fermentation

2.1.3 食盐添加量对鱼露发酵的影响

鱼露发酵过程中食盐含量的多少对鱼露风味和品质的形成有着重要的影响。由图3可知，随着食盐添加量的增加，鱼露中氨基酸态氮的含量随之减少，并且当食盐添加量小于8%时差异不显著(p>0.05)。可见盐分的增加抑制了长孢洛德酵母的代谢，在保证鱼露风味的情况下，食盐添加量越低，风味鱼露的品质越高。同时，随着食盐添加量的增加，鱼露的风味感官值呈先上升后下降的趋势，并且在食盐添加量为6%时风味感官值最高。可能是因为食盐不仅影响微生物代谢产生风味物质，本身也带给鱼露特殊的风味。综合不同食盐添加量下鱼露中氨基酸态氮含量和风味感官值的结果可以看出，长孢洛德酵母发酵生产风味鱼露的较适宜食盐添加量为6%。

图3 食盐添加量对鱼露发酵的影响Fig.3 Effect of salt addition amount on fish sauce fermentation

2.1.4 发酵温度对鱼露发酵的影响

温度是影响鱼露发酵的重要因素之一。由图4可知，30 ℃和35 ℃下鱼露的氨基酸态氮含量以及风味感官值与其他温度下的差异显著(p<0.05)。当发酵温度低于35 ℃时，鱼露的氨基酸态氮含量和风味感官值随着发酵温度的升高而升高；当温度高于35 ℃时，鱼露的氨基酸态氮含量和风味感官值随着发酵温度的升高而降低。这可能是因为当温度较低时，微生物及酶的活性较低，鱼露的发酵进程受到影响，发酵不完全；当温度较高时，抑制了微生物的活性，部分蛋白酶的稳定性也遭到破坏，使得微生物和蛋白酶无法充分发挥作用，从而导致鱼露中的小分子多肽、游离氨基酸等含量减少，进而影响了鱼露的风味和品质。因此，综合以上分析可以看出，长孢洛德酵母发酵生产风味鱼露的较适宜温度为35 ℃。

图4 发酵温度对鱼露发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on fish sauce fermentation

2.1.5 发酵时间对鱼露发酵的影响

适宜的发酵时间使得底物中蛋白质、脂质、糖类等营养物质可以被微生物充分利用，产生丰富的风味物质；发酵时间过长会导致鱼露的酸度升高，对鱼露的口感造成不利影响[16]。由图5可知，随着发酵时间的延长，鱼露中氨基酸态氮含量逐渐升高，当发酵25 d后，氨基酸态氮含量差异不显著(p>0.05)。而鱼露的风味感官值随着发酵时间的延长逐渐升高，但在发酵35 d时风味感官值降低。发酵25 d比30 d的感官评分值稍高，但差异不显著(p>0.05)。考虑到两者间氨基酸态氮含量增加趋势不明显，并且节约时间和成本因素，因此选择长孢洛德酵母发酵生产风味鱼露的较适宜时间为25 d。

图5 发酵时间对鱼露发酵的影响Fig.5 Effect of fermentation time on fish sauce fermentation

2.1.6 风味鱼露发酵条件优化

为了得到风味品质较高的鱼露产品，对长孢洛德酵母发酵生产风味鱼露的工艺条件进行了优化。在单因素试验结果的基础上，确定种曲添接种量为4%的条件下，对食盐添加量、蔗糖添加量、发酵温度以及发酵时间进行了正交优化试验，结果见表2。

表2 鱼露发酵正交优化试验结果Table 2 The results of orthogonal optimization experiments for fish sauce fermentation

以氨基酸态氮含量为指标可以看出，4个因素对风味鱼露发酵结果影响大小顺序为A>D>B>C，即食盐添加量>发酵时间>蔗糖添加量>发酵温度。长孢洛德酵母发酵风味鱼露的最佳发酵工艺条件为A2B3C1D2，即食盐添加量6%、蔗糖添加量3.5%、发酵温度30 ℃、发酵时间25 d，此条件下风味鱼露中氨基酸含量最高。以风味感官值为评定指标时，4个因素对鱼露发酵影响大小顺序为D>C>A>B，即发酵时间>发酵温度>食盐添加量>蔗糖添加量。优化后的最佳组合为A2B2C2D2，即食盐添加量6%、蔗糖添加量3%、发酵温度35 ℃、发酵时间25 d，此条件下风味鱼露的感官最好。由于两个指标的最优发酵条件不一致，因此采用综合平衡法进行评判。蔗糖添加量和发酵温度对鱼露风味的影响比氨基酸态氮含量大，而3%的蔗糖添加量比3.5%的蔗糖添加量风味感官值低，35 ℃发酵温度的风味感官值也高于30 ℃，因此确定3%的蔗糖添加量、35 ℃的发酵温度作为优化后的条件。综合以上分析可知，鱼露的最优发酵条件组合为A2B2C2D2，即在确定种曲添接种量为4%的条件下，食盐添加量6%、蔗糖添加量3%、发酵温度35 ℃、发酵时间25 d时。在此条件下，风味鱼露的氨基酸态氮含量为8.703 mg/mL，风味感官值为9.524，均高于单因素试验以及正交试验结果，鱼露咸淡适中，具有浓郁的鲜味且略带水果香味。

2.2 风味鱼露品质评价

2.2.1 常规理化指标分析

我国鱼露的行业标准中规定一级鱼露中总氮含量应大于1.2 g/dL，氨基酸态氮含量应大于0.9 g/dL，而二级鱼露氨基酸态氮含量应大于0.65 g/dL[17]。两种鱼露中常规理化指标测定的结果见表3。

表3 鱼露常规理化指标Table 3 The conventional physical and chemical indexes of fish sauce g/dL

由表3可知，风味鱼露中总氮含量为1.53 g/dL，高于一级鱼露的标准；而氨基酸态氮含量为0.87 g/dL，接近一级鱼露标准。虽然风味鱼露中总氮、氨基酸态氮的含量较市售鱼露中低，但差别较小。由于制作工艺的差别，风味鱼露中食盐含量远低于市售鱼露，说明在满足营养需求的基础上，风味鱼露更加有利于健康。

2.2.2 游离氨基酸分析

氨基酸的组成和含量对鱼露的风味与营养有着重要的影响。两种鱼露中游离氨基酸含量的测定结果见表4。

表4 鱼露中游离氨基酸测定结果Table 4 The determination results of free amino acids in fish sauce

由表4可知，两种鱼露中氨基酸组成基本相似，但在每种氨基酸的含量上差别较大。风味鱼露和市售鱼露中氨基酸总量分别为3.924，4.081 g/dL，总含量差别较小。风味鱼露中，Leu、Lys、Glu等氨基酸的含量较高，Pro含量较低；而市售鱼露中含量较高的分别是Gly、Glu、Cys-s等氨基酸，含量最低的是Arg，两者差异较大。此外，风味鱼露中必需氨基酸总量为1.842 g/dL，占氨基酸总含量的46.94%，远高于市售鱼露中必需氨基酸的含量(1.211 g/dL, 29.67%)，超过联合国粮农组织以及世界卫生组织对氨基酸理想模式中必需氨基酸占氨基酸总量比值40%的规定[18]，营养较为均衡。另外，Glu、Thr、Ala、Val也已被报道为鱼露中的有效鲜味成分[19]，而这些氨基酸在风味鱼露中含量也较高。

2.2.3 鱼露中组胺含量分析

鱼露在发酵过程中会产生大量的生物胺，其中组胺含量最高，对人体的毒害作用最大[20]。因此，控制鱼露中组胺含量对鱼露的食用安全有着重要影响。市售鱼露(A)和风味鱼露(B)中组胺含量的检测结果见图6。

由图6可知，市售鱼露中组胺含量为88.3 mg/kg，风味鱼露中组胺含量为9.6 mg/kg，风味鱼露中组胺含量远低于市售鱼露。这可能是由于传统市售鱼露在发酵过程中开放式发酵体系和较长的发酵周期，造成了杂菌的生长繁殖及组胺累积，而风味鱼露的密闭发酵环境及较短发酵周期有效避免了这个缺陷。

图6 鱼露中组胺检测结果Fig.6 The test results of histamine in fish sauce

2.3 鱼露挥发性风味物质分析

风味鱼露与市售鱼露中挥发性化合物的总离子流图见图7。

图7 两种鱼露中挥发性物质总离子流图Fig.7 Total ion flow diagrams of volatile compounds in Sardinops sagax fish sauce (A) and commercial fish sauce (B)

由图7可知，风味鱼露与市售鱼露中挥发性化合物的种类及含量差别明显，对这两种鱼露中挥发性化合物进行定性分析。

风味鱼露和市售鱼露中各类挥发性风味化合物的数量和含量见表5，可以清晰地比较出两种鱼露挥发性化合物的差异。风味鱼露中，含量最多的为醇类化合物，共17种，占55.24%；其次为酸类化合物，占23.11%。而市售鱼露中含量最高的为酸类化合物，共13种，占60.36%；其次为酚类化合物，占比11.95%。主要挥发性化合物含量的差异直接导致了两种鱼露风味上的差别，且由于醇类化合物大多呈香甜的果香[21]，导致风味鱼露带有水果香味，这与感官评价的结果一致。

表5 鱼露中各类挥发性风味物质的数量和含量Table 5 The quantity and content of various volatile flavor substances in fish sauce

3 结论

本试验对远东拟沙丁鱼低盐风味鱼露的发酵工艺进行了正交试验优化，并与市售鱼露的品质和挥发性风味物质进行了比较。结果显示：在风味鱼露发酵过程中，接种4%的长孢洛德酵母种曲，加入6%的食盐并且添加3%的蔗糖作为碳源，在35 ℃下发酵25 d时，鱼露中总氮含量为1.53 g/dL，氨基酸态氮含量为0.87 g/dL，必需氨基酸含量与氨基酸总量的占比超过40%，营养均衡；组胺含量远低于市售鱼露，食用安全性较高。此工艺条件下生产的风味鱼露，不仅发酵周期短，鱼露中营养物质也较为均衡，食用安全性高；并且其挥发性化合物中具有果香味的醇类化合物含量占比55.24%，明显区别于市售鱼露中的主要挥发性化合物和种类，本研究为一种新型风味鱼露的开发提供了理论基础。