微生物发酵技术对广味香肠安全性提升的研究

田甜，詹锐琪，张雅琳，潘攀,孙劲松，张巍，王新惠，刘洋*

(1.成都农业科技职业学院，成都 611130；2.成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106)

广味香肠作为中国特色的传统腌腊肉制品之一，因其独特的风味深受消费者喜爱。传统广味香肠发酵主要依靠自然发酵，存在亚硝酸盐残留量高、生物胺含量高和脂肪氧化严重等食用安全性问题，已受到国内外研究人员的高度关注，如何提升广味香肠的食用安全性，已成为研究的热点课题之一。Kim等和杨晶等[1,2]研究表明，乳酸菌可分泌亚硝酸盐还原酶，在厌氧条件下可降解亚硝酸盐，可显著降低香肠中亚硝酸盐的残留量；Gardini等和Komprda等[3,4]研究表明，Pediococcuspentosaceus和Staphylococcusxylosus可促进生物胺的降解；酵母菌可促进香肠风味的形成[5]。由此可见，采用优良微生物发酵制作香肠，可控制香肠中的优势菌群，并可利用微生物的独特性能改善发酵香肠的风味和安全性[6-8]。

本文将戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)5种微生物制备成的复合发酵剂接种于广味香肠中，以自然发酵为对照，测定分析了香肠发酵过程中pH、Aw、亚硝酸盐残留量、组胺含量和酸价等，旨在研究复合发酵剂对广味香肠安全性的影响，以期为改善传统广味香肠质量和食品安全性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 原辅料

卫生检疫合格的新鲜猪肉、肠衣、食用级食盐、味精、蔗糖等：均购于成都龙泉驿区成都大学十陵鑫大百货超市。

1.2 复合发酵剂

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)：均由肉类加工四川省重点实验室从自然发酵的香肠中分离获得，5种菌以1∶1∶1∶1∶1制作成冻干粉。

1.3 主要试剂

磷酸组胺标准品和衍生剂丹磺酰氯：购于Sigma公司；乙腈(Bessldorf公司)、正丁醇、三氯甲烷、乙酸、乙酸铵、氯化钠、盐酸、谷氨酸钠、碳酸氢钠、亚铁氰化钾、亚硝酸钠、氢氧化钾、酚酞、乙醇、乙酸锌、对氨基苯磺酸等：均为国产分析纯，购于成都市科隆化学品有限公司。

1.4 主要仪器与设备

Testo 205肉类专用pH计 德国仪表国际贸易(上海)有限公司；HD-3A型智能水分活度仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；JA3103N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；RC-III-20L超纯水机 成都瑞昌仪器制造有限公司；LD-5离心机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；721可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。

1.5 香肠制作

1.5.1 香肠配方

瘦肉∶肥肉为3∶1，其他辅料的比重按照肉的重量计，蔗糖0.3%，盐2.6%，葡萄糖0.4%，抗坏血酸(维生素C)0.06%，NaNO2150 mg/kg，水5%，添加复合发酵剂0.04%，不添加其他香辛料。

1.5.2 工艺流程

原料肉→修整→腌制→绞碎→拌料→灌肠→发酵→成熟。

1.5.3 操作要点

将猪肉切成1.5～2 mm左右同样大小的肉丁，将切好的肉丁在冰箱冷藏室(3～7 ℃)冷藏24 h，加入调料，混合均匀后再在低温下腌制24 h；直投入冻干复合发酵剂，接种量为0.04%(W/W)，然后采用手工灌肠，每节香肠大概是10 cm，用针扎香肠中有气泡的地方；灌好的香肠挂放在恒温恒湿发酵箱中，控制发酵温度在20～25 ℃，相对湿度在91%～96%，发酵3 d，最后控制温度在16～18 ℃，相对湿度是75%～80%，直到香肠成熟，以自然发酵为对照。

1.6 实验方法

1.6.1 Aw值的测定

取香肠前、中、后三部分的肉切碎，混匀，每次称量5 g肉平铺在水分活度仪测定盒的底部，称量3次，取平均值。

1.6.2 pH值的测定

采用德国Testo 205肉类专用pH计穿刺电极插入香肠前、中、后重复测定3次，取平均值。

1.6.3 酸价的测定

参照GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》测定香肠中的酸价[9]。

1.6.4 亚硝酸盐的测定

依据GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》方法测定香肠中亚硝酸盐的含量[10]。

1.6.5 组胺的测定

参考王新惠等[11]的方法测定香肠中的组胺含量。

1.7 数据分析

每个样品做3次平行检测。数据分析采用Matlabver.2006b(Mathworks Inc.，Natick，MAUS)和Microsoft Excel(Microsoft，Redmond，Washington，US)。所有数据由平均值±标准偏差组成。

2 结果与分析

2.1 接种复合发酵剂对广味香肠pH值的影响

接种复合发酵剂对广味香肠pH值的影响见图1。

图1 接种复合发酵剂香肠和自然发酵香肠pH的变化Fig.1 Changes of pH of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermentated sausage

由图1可知，自然发酵组随着时间的延长，pH降低，接种发酵剂组的pH随着时间的延长先降低后缓慢上升，在发酵第9天时，发酵剂组的pH值最低达4.51，最后，接种复合剂发酵的香肠pH值是4.57，自然发酵组的pH值是5.41，接种组的pH值比自然发酵组低15.53%。

接种发酵组中的戊糖片球菌和清酒乳杆菌都具有较强的碳水化合物分解能力[12,13]，在香肠的发酵和成熟过程中会产生大量乳酸，使pH值快速下降。pH值在达到最低值后都有缓慢的回升，最后趋于稳定，出现这样的情况可能是由于微生物或酶的作用分解蛋白质后产生的碱性物质对发酵期间产生的酸起到了缓冲作用，也有可能是乳杆菌在生长繁殖的过程中产生了大量的乳酸后抑制了自身的生长。pH是香肠在发酵过程中的关键指标，低pH值是食品防腐的重要栅栏因子，是控制发酵香肠安全的关键因素之一，pH值在4.6以下可提升香肠的微生物卫生指标[14]。本实验中接种复合发酵剂组发酵结束时pH值达到4.57，低于4.6，而对照组是5.41。由此可见，添加复合发酵剂可通过降低广味香肠的pH值来提升香肠的安全性。

2.2 接种复合发酵剂对广味香肠Aw值的影响

接种复合发酵剂广味香肠的Aw值随时间的变化见图2。

图2 接种复合发酵剂香肠和自然发酵香肠Aw的变化Fig.2 Changes of Aw of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermented sausage

由图2可知，自然发酵和添加复合发酵剂的广味香肠的Aw随着时间的延长而降低，Aw值在发酵第3天后快速降低。在第15天后，两组香肠的Aw值都达到一个较平稳的状态，自然发酵组最后的Aw值是0.798，而接种组的Aw值是0.779，接种组的Aw值比自然发酵组低2.38%。

Aw值也属于栅栏因子，快速降低发酵食品的Aw有利于抑制有害微生物的增长，当Aw值低于0.9时，食品中许多有害微生物的代谢会受到抑制[15]。由图2还可知，自然发酵和接种发酵香肠的Aw值都在一个安全值下，最后，接种香肠的Aw值是0.779，而自然发酵香肠的Aw值是0.798。在整个过程中接种发酵剂的Aw值始终比自然发酵香肠的Aw值低，Marcos等发现接种肉葡萄球菌和清酒乳酸杆菌后，发酵环境中的蛋白酶活性会增加[16]，所以接种发酵剂的香肠蛋白质发生降解，香肠的持水性降低，凝胶保水性降低，导致广味香肠中的水分更容易丢失[17]。可见，添加合适的发酵剂可以提高香肠的食用安全性。

2.3 接种复合发酵剂对广味香肠酸价的影响

接种复合发酵剂香肠的酸价随时间的变化见图3。

图3 接种复合发酵剂香肠和自然发酵香肠酸价的变化Fig.3 Changes of acid value of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermented sausage

由图3可知，接种香肠和自然发酵香肠的酸价都随着时间的延长而增大，但是接种香肠的酸价低于自然发酵。在后期，广味香肠的酸价上升很快，最后，自然发酵香肠的酸价是4.5 mg/kg，接种发酵香肠的酸价是4.22 mg/kg，接种发酵香肠比自然发酵香肠低6.22%。

香肠因为是肉制品，在发酵和成熟过程中，难免会发生脂肪的氧化。脂肪的氧化分为两步，脂肪进行水解，进而发生氧化。脂肪氧化生成的小分子醛酮物质正是香肠的风味来源，适当的脂肪氧化是有益的，过度的脂肪氧化会导致食物的酸败，产生“哈喇味”，酵母和凝固酶阴性球菌因为对发酵食品的风味有所贡献，所以经常作为发酵剂用于发酵食品[18]。

张大磊等发现在发酵环境中，主要是葡萄球菌和微球菌产生脂肪水解酶[19]，而在香肠发酵的前期，香肠的酸价缓慢上升，可能是因为前期酵母菌和乳酸菌的增长会消耗大量的氧气，不仅可以通过降低发酵环境的pH值来抑制脂肪氧化酶的活性，还可以抑制发酵产品的酸败[20]。在后期，酵母的需氧量减少，前期积累的游离脂肪酸开始氧化，导致酸价急剧升高。

2.4 接种复合发酵剂对广味香肠亚硝酸盐的影响

接种复合发酵剂香肠的亚硝酸盐含量随时间的变化见图4。

图4 接种复合发酵剂香肠和自然发酵香肠亚硝酸盐的变化Fig.4 Changes of nitrite of sausage inoculated with compoundfermentation agent and natural fermented sausage

由图4可知，发酵初期，自然发酵和接种香肠都增加，在第3天后，亚硝酸盐的含量开始降低，在第23天后，亚硝酸盐含量开始增加，最后达到一个比较平衡的状态。最后，接种香肠的亚硝酸盐含量为1.95 mg/kg，而自然发酵组的亚硝酸盐含量为2.17 mg/kg，接种香肠的亚硝酸盐含量比自然发酵香肠低10.14%。

在香肠发酵初期，发酵环境中的菌群种类丰富，所以杂菌较多，杂菌可以将硝酸盐大量转化成亚硝酸盐，并且在初期发酵剂的丰度比较小，综上可知，从发酵后的第3天开始，亚硝酸盐的降低可能有3个原因：第一，pH的继续下降，杂菌的代谢开始得到抑制，无法转化硝酸盐为亚硝酸盐；第二，亚硝酸盐在一定的酸性条件下能生成亚硝酸，从而与肌红蛋白反应，发酵环境中的亚硝酸盐含量开始降低；第三，乳酸菌属等产生的亚硝酸还原酶还原了亚硝酸盐。后期亚硝酸盐的增长可能是因为分解蛋白质积累了大量的氨，环境中的亚硝酸单胞菌进行硝化作用导致亚硝酸盐增长[21]。亚硝酸盐在肉制品中常用作着色剂、抗氧化剂和抑菌剂，最重要的是可以抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长[22]，所以目前没有其他添加剂可以代替它。但是亚硝酸盐在食物中残留过大，会导致身体组织缺氧而使健康受损，最大的忧患是亚硝酸盐和胺类物质生成致癌致畸的亚硝胺。

2.5 接种复合发酵剂对广味香肠组胺的影响

接种复合发酵剂香肠的组胺含量随时间的变化见图5。

图5 接种复合发酵剂香肠和自然发酵香肠组胺的变化Fig.5 Changes of histamine of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermented sausage

由图5可知，自然发酵和接种香肠的组胺含量从发酵第1天以后开始增加，在第3天后开始下降，第8天到第28天时，香肠内的组胺含量比较平稳，但是在第28天后组胺含量短暂上升后降低。最后，接种香肠的组胺含量为1.14 mg/kg，而自然发酵香肠的组胺含量为1.51 mg/kg，接种香肠的组胺含量比自然发酵香肠低24.5%。

组胺的生成要有游离的组氨酸和可以产生氨基酸脱羧酶的微生物。起初，发酵环境中大量的菌群利用游离的组氨酸快速地生成组胺，导致在初期组胺的含量增高。在乳酸菌属等产生乳酸后，发酵环境的pH开始下降，氨基酸脱羧酶的活性开始受到限制，并且发酵环境中杂菌的生长也被抑制，所以组胺的含量并没有继续增加。许多的微生物可以产生组胺降解酶等来减少组胺，Lu等发现发酵剂中的清酒乳酸杆菌和木糖葡萄球菌可以降低香肠内的组胺含量[23]，所以在第3天后，组胺的含量降低并且保持在一个较稳定的水平。在第28天后，组胺的突然增长可能是因为发酵环境中的pH出现短暂的增高，导致对氨基酸脱羧酶的活性抑制解除了，积累的氨基酸脱羧酶快速作用于组氨基酸，所以组胺会出现短暂的升高后降低。组胺和酪胺是生物胺中毒性最强的，误食过量组胺会导致人体出现呼吸困难、呕吐等中毒症状。结果说明，接种复合发酵剂的香肠的组胺含量有降低，有利于提高食用安全性。

3 结论

因为香肠是中国传统的发酵食物，在近几年因为消费者对食品的安全性意识提高，所以对发酵食物的要求更高，接种香肠不仅可以提高食用安全性，还可以提高产品的风味等。接种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)5种微生物制备成的复合发酵剂的广味香肠的pH和Aw都比自然发酵香肠低了15.53%、2.38%，pH和Aw是栅栏因子，是食品保藏的重要参数，低pH和低Aw的发酵食品不仅可以增长食品的保藏期，还可以提高食品的微生物卫生指标、安全性指标、脂肪的氧化、亚硝酸盐和组胺在广味香肠中的含量，由此可以看出，接种复合发酵剂的广味香肠的亚硝酸盐含量、组胺含量和酸价比自然发酵剂香肠分别降低了6.22%、10.14%和24.5%。结果表明，接种复合发酵剂的广味香肠的食用安全性比自然发酵香肠高。