贵州油茶炭疽病Colletotrichum fioriniae病原鉴定研究

2019-11-13秦绍钊洪之国王建伟

福建茶叶 2019年8期

秦绍钊，洪之国，王建伟

（1.凯里学院；2.黔东南州农产品质量安全检测中心，贵州凯里 556011）

油茶（Camellia oleifera Abel），是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia），油茶是世界四大木本食用油料植物之一[1]，为贵州地区的乡土树种，栽培历史悠久，种植区广泛，主要分布在黔东南州、铜仁市、黔西南州、毕节市等地区，山区群众具有丰富的油茶种植经验。截至2018年种植面积达263.4万亩，随着油茶种植面积的扩大和良种使用率的提高，贵州油茶的病害问题日趋严重。油茶炭疽病主要危害油茶的叶、果实及枝梢，造成重大的经济损失[2]。

油茶炭疽病发病的区域经田间调查观察，结合前期研究和的报道[3,4]。熊朝伟等，2019报道玉屏油茶炭疽病为Colletotrichum camelliae[5]。本研究所鉴定的油茶炭疽病松针刺盘孢菌（Colletotrichum fioriniae）在贵州油茶病害研究中未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

2015-2018年采集病叶片于黔东南州天柱县、锦屏县及黄平县；铜仁市玉屏县、江口县及松桃县，分别集中于在6-7月，10-11月采集病样，典型病征（如图1-1）。病斑多为梯半圆形、不规则形，多为半叶型；病斑颜色为黄褐色，病斑部位薄且脆，密生小黑点或凸起，4℃保藏带回实验室进行病原菌分离试验。

图1-1 油茶炭疽病病叶

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化

常规组织分离法：先用75%的酒精处理病健交界的组织，0.1%升汞溶液消毒，无菌水漂洗干净，PDA培养基纯化培养，置于4℃下保存备用。

1.2.2 病原菌的形态鉴定

取5mm菌饼，在PDA平板26-28℃黑暗16h培养，2-5d连续观察菌落的形态、颜色。取10μL分生孢子悬浮液在光学显微镜下观察记录其大小及形态特征。

1.2.3 分子鉴定与系统发育分析

取20 mg菌丝经液氮研磨，样品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒，Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒SK8259。扩增引物如下：GpF：5’ATGTGCA AGGCCGGTTTCGC3’，GpR 5’TACGAGTCCTTCTGGCCC AT3’；ACTF5’GCCGTCAACGA CCCCTTCATTGA 3’，ACTR5’GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT3’。

将测序rDNA-ACT和rDNA-GADPH序列与GenBank中下载的相关参考序列分别用ClustalX1.83软件进行比对分析。在多基因系统发育分析结果中选出与各分离菌株相似度较高的相应序列，将所选序列与Gen-Bank中炭疽菌相应基因序列采用MEGA7.0.14软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）做聚类分析，碱基序列间的空缺（Gaps）作为碱基缺失处理；把所有的碱基状态处理为无序，并给以相同的权重。自举检验（bootstraping）重复1000次以获得各分支的支持率，构建邻近法（NJ）系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病原菌菌落与形态特征

PDA培养基上菌落直径为8.4-8.9cm，菌落边缘整齐，辐射状，气生菌丝浓密，菌丝白色，呈疏松绒毡状，中央为灰色至灰绿色，边缘为白色（如图2-1 A），菌落反面为深灰色至白色（如图2-1B）。分生孢子椭圆、细长梭形、短梭形；无色、无油球；表面光滑；4.8～19.8×2.7～3.9μm（如图2-2）。

Colletotrichum fioriniae首先被认为是尖孢炭疽菌（C.acutatum）的变种（C.acutata var.fioriniae）。本研究分离的代表菌株KLXYL-1-4的菌落形态、分生孢子形态与文献描述一致，初步确认菌株KLXYL-1-4为Colletotrichum fioriniae(Marcelino&Gouli)R.G.Shivas&Y.P.Tan Fungal Diversity 39:117(2010)。

图2-1 KLXYL-1-4培养基的菌落（A正面，B反面）

图2-2 KLXYL-1-4的分生孢子

2.2 分子鉴定

本研究5个分离菌DNA为模板，对其肌动蛋白基因（ACT）和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）进行扩增并测序。NCBIBlastn比对后，确定5个菌株同属于炭疽菌属松针刺盘孢菌，与形态学鉴定结果一致。

代表菌株KLXYL-1-4的ACT和GADPH基因序列与其它同属菌株序列经邻接法（neighbor-joining，NJ）共同构建的系统发育树中，KLXYL-1-4菌分别与松针刺盘孢菌（C.fioriniae）菌株KY986902.1和KF944354.1聚为一个独立的进化枝，亲缘关系置信度高达99%，能与同属其它菌株明显区分开。因此，根据分离所得鉴定结果将KLXYL-1-4菌株鉴定为C.fioriniae。