茶树‘龙井43’扦插不定根发生过程生理机制研究

左巧丽，谷 星，王超军，鲁占领，鲍 露

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）

我国是世界上最大的产茶国，茶（Camellia sinensis）产业化的必经之路是实现良种无性繁殖，这种繁殖方式被广泛应用于植物中，尤其是木本植物。目前，短穗扦插也成为茶树无性繁殖的主要方式。茶树扦插的成活率主要在于不定根的形成，茶树不定根的产生过程，从形态上大致分为愈伤组织形成期、根原基形成期、根端伸长期以及根系形成期。它属于一个复杂的生物学过程，并同时受到内外不同因素的调控。内在因素主要在于内源激素的变化、酶活性的变化以及酚类物质含量的变化等，而吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）是目前公认的与不定根关系最密切三种酶类。外在因素主要是环境因子，如温度、光照、水分等。

有研究报道认为生长素对不定根的形成起着关键作用，在茶树中，生长素萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）被广泛应用于诱导不定根的形成，柴红玲等发现NAA对茶树扦插生根率的提高极显著优于其他外源激素，但是关于NAA对茶树不定根形成过程中的诱导的机理性研究还较少。本研究以‘龙井43’为试材，用300 mg/LNAA处理插穗，清水处理作为对照，研究扦插过程中相关的内源激素、酶活性（IAAO、PPO、POD）、茶多酚等多种指标变化，主要的目的是通过这些处理来得到在生根过程茶树生理生化的动态变化，为加快茶树扦插生根速率提高成活率提供理论参考和技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

国家无性系良种‘龙井43’为试材，选择当年生半木质化健壮、无病虫害的枝条剪取插穗，于陕西省汉中贯山育苗基地进行试验，插穗剪下后用300 mg/LNAA处理插穗底部30 min，同时以清水处理作为对照，每个处理设置3个重复，每个重复200株插穗。以扦插苗1 d、3 d、5 d、15 d、30 d、45 d以备使用，并测定生根过程中的内源激素含量、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）的活性、及茶多酚含量。

1.2 试验方法

1.2.1 测定内源激素含量

内源激素含量的测定采用间接酶联免疫法（ELISA）参考唐尚格的方法，其中包括脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）、吲哚乙酸（IAA）水平的测定。

1.2.2 测定酶活性

PPO活性的测定参考张正竹，酶活以每克样每分钟内A460增加0.1为一个活力单位，计算公式如下：酶活力，A代表反应终止时460nm的吸光度值，m代表干重g，t代表反应时间min。POD活性的测定参考刘萍的方法，在470nm波长处测定A470值的变化。IAAO活性以每克样每分钟内A470吸光度变化0.01为一个酶活力单位。IAAO活性以每毫升酶液每小时分解破坏IAA的量（ug）表示酶活力大小。

1.2.3 茶多酚含量的测定

采用酒石酸亚铁比色法，茶多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，在一定波长下有最大吸收。在适当的浓度范围内，多酚的含量与络合物的吸光度成正比，故用分光光度法对茶多酚定量分析。

1.2.4 数据分析

用SPSS 17.0对数据进行单因素方差分析（ANOVA）。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 内源激素含量的变化

通过对根系内源激素含量的测定，可以看出经过NAA处理的扦插苗和清水对照处理的扦插苗（图1）。扦插苗插穗的ABA含量在扦插的过程中有短暂下降的过程，1～5 d的时候，开始出现上升，之后又再次出现降低，无论是哪种处理，30 d的时候又进入上升的趋势（图2）。经过NAA处理的扦插苗的插穗与对照处理的扦插苗的插穗的韧皮部内源GA3活性变化一致，先降低，再高升，后降低的趋势（图3）。经过NAA处理的扦插苗的插穗的ZR含量在第5d的时候出现了高峰，而对照处理的扦插苗的插穗的ZR含量的高峰期在第30d的时候出现（图4）。

2.1.2 酶活性变化

生根的前期NAA处理和CK插穗中

PPO的活性均在第15 d达高峰，然后出现急剧下降的现象（图5）。POD活性的变化，在两个处理中均表现出下降→上升→下降→上升的变化趋势，但NAA处理的较对照有所提高（图6）。插穗中IAAO的含量变化情况如图7，清水对照处理的插穗叶片和NAA处理插穗叶片IAAO活性均出现先升后降变化情况。

2.1.3 茶多酚含量变化

对照处理插穗茶多酚含量下降，上升，下降的情况，与NAA相反，茶多酚的含量呈现出下降→上升→下降→上升趋势（图8）。这种情况的出现多是PPO活性升高然后可能催化IAA和酚类物质形成“IAA-酚酸复合物”，最终使茶多酚下降。

2.2 讨论

2.2.1 内源激素的变化与不定根的形成

扦插后第1 d IAA含量大幅度下降，主要原因可能是与早期的细胞分裂与根原基的组建有关，第30 d时，NAA插穗中的IAA含量高于对照，达到了最高峰（图1）。说明IAA初期的升高在根愈伤形成及不定根发生过程中非常重要。在生根的过程NAA插穗的内源IAA的含量高于对照，生根率也远远高于对照。由外源生长调节剂NAA处理的插穗中的内源IAA可能被促进，从而有利于不定根发育和伸长。促进不定根的形成萌发与伸长生长的激素极有可能是内源激素IAA，与形成层形成位点诱导和第1次细胞分裂启动有很大关系。ABA的含量前期出现上升的情况（图2），主要可能是降低逆境对插穗的损伤的原因。在愈伤组织诱导期和根源基诱导期，5～30 d的时候出现了明显的下降，这种情况说明低浓度的内源ABA对茶树生根有促进作用。ABA是植物体内一种抑制性植物激素，但是低浓度的ABA有促进植物生根的作用，高浓度ABA抑制IAA的运输和离体器官的生长，抑制生根的形成。GA3含量无论是对照还是处理，在第15～30 d都出现明显的下降（图3），此阶段根的愈伤明显形成，说明低浓度的GA3在根愈伤形成期间起到了重要作用，与前人研究结果一致。NAA处理可以将ZR的高峰期提前（图4）。

2.2.2 酶活性的变化与不定根的形成

NAA处理的插穗PPO活性高于对照（图5）。PPO对于IAA与酚类物质的快速缩合而形成“IAA-酚酸复合物”有催化作用，这种复合物对不定根形成萌发和伸长生长有促进作用。PPO变化的趋势（图5）可以明白在不定根形成的早期PPO活性高，后期PPO活性显著下降，说明PPO对根原基形成起着重要作用。NAA处理插穗POD活性变化趋势和对照处理插穗接近一致，呈先下降，再上升，后下降，最后上升，但与对照相比提高了（图6）。在茶树根诱导期，POD活性上升氧化IAA，消除了插穗体内过多内源IAA，有利于诱导根原基的发育。插穗的POD活性出现下降，使插穗体内IAA含量出现上升的情况，对不定根的形成有促进，随后POD活性出现升高。就IAAO活性变化水平而言，对照处理低于激素NAA处理（图7），变化的趋势也更为简单。IAA分解的专一性的酶是IAAO，这种酶通过O2对IAA氧化。高活性IAAO对植物体内IAA的水平有降低的功效。

2.2.3 茶多酚含量变化与不定根的形成

生根过程NAA处理的插穗的茶多酚含量的变化与对照变化的趋势稍有不同（图8）。

3 小结

茶树插穗内源激素通过自我调控变化达到有利于生根的水平。插穗在刚开始时（脱离母体），内源激素等物质会迅速由叶片向生根部位进行运输。而且在伤口部位过氧化物酶活性会增强，在愈伤组织形成及根原基孕育期IAA，ZR含量不断增加、积累并维持在较高水平,以诱导生根，生根后下降，以利于生长；研究结果显示：内源激素与不定根的产生表现出不同的相关性：其中高含量的IAA、IAA/ABA与不定根产生成正相关，ZR、GA3、ABA与不定根的产生成负相关；就吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）的活性而言，经过NAA处理的插穗高于对照插穗；生根过程NAA处理的插穗的茶多酚的含量呈现出的趋势为下降→上升→下降，对照的趋势与NAA正好相反，茶多酚的含量呈现出下降→上升→下降→上升的趋势。