肉牛呼吸道疾病综合征的病原学检测

张颖慧，岳 华.2，马艳君，冉 艾，何琪富，汤 承.2

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都 610041)

牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)是严重危害肉牛养殖业的一类疾病，对全世界肉牛养殖业造成巨大的经济损失[1].BRDC 在临床上主要以流鼻涕、咳嗽、精神沉郁、食欲下降、呼吸困难等症状为特点. 由于BRDC 危害严重，国外对其进行了大量的研究，已证实其病原包括病毒、细菌和支原体等.在临床上，病毒感染牛呼吸道后造成牛呼吸道上皮细胞受到破坏，并可能抑制机体免疫系统，在继发细菌性感染时加重BRDC 的临床症状[1].已经证实的致BRDC 的病毒包括：牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛病毒性腹泻- 黏膜病病毒(bovine viral diarrhoea virus， BVDV)、牛副流感3 型病毒(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛腺病毒3 型(bovine adenovirus type 3，BAV3)、牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)、D 型流感病毒(influenza D virus，IDV)、牛鼻炎A 病毒(bovine rhinitis A virus，BRAV)和牛鼻炎B 病毒(bovine rhinitis B virus，BRBV)等病毒[2]；常见的细菌包括：多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，P.multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica，M. haemolytica)和睡眠嗜组织菌(Histophilussomni，H.somni)等细菌[1]；尽管感染牛的支原体种类较多[3]，但在BRDC 中牛支原体(Mycoplasma bovis， M.Bovis)为主[1].临床上不同的地区的BRDC，其病原种类可能存在差异，且常呈混合感染[4-5]，使得其诊断和防治变得困难.

随着我国经济的快速发展，人们物质生活的提高，对牛肉的需求越来越大.加之国家政策的扶持，肉牛养殖业发展迅速[6]. 由于国内肉牛种源的相对缺乏，从外地引进犊牛或者架子牛进行短期育肥[7]，是包括四川省在内的很多地方肉牛养殖的普遍现状.运输应激是BRDC 爆发的重要诱因，从异地引进牛群造成的运输应激，使机体抵抗力降低，从而导致牛群BRDC 的爆发[8]，已经成为制约国内肉牛养殖的一个重要问题[9]. 由于我国对BRDC 的相关研究起步较晚，防控基础薄弱[10]，进一步加强国内BRDC 的病原流行病学调查，是制定科学防控策略的前提.

目前，国内已鉴定的BRDC 的病原包括IBRV、BRSV、BPIV3、BAV3、BVDV、BCoV、M. Bovis、P. multocida 和M.haemolytica 等[11-13]，但是其病原流行病学资料还较少. 对我国多地奶牛BRDC 的病原检测表明，IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BRSV 等病毒感染普遍[14-16]，并且个别地区M. Bovis 和P. multocida 感染率很高[10]. 尽管在生产实际中肉牛BRDC 已经成为制约肉牛养殖业健康发展的重要问题[9]，但是目前国内肉牛BRDC 病原流行病学资料较少[12]，且对病毒、细菌和支原体等多种病原混合感染情况的调查报告仅有一篇[17].本实验目的是对四川省11 个从外地引种肉牛群爆发的BRDC 临床样本中10 种常见的病原，包括病毒、细菌、支原体等进行检测，为国内肉牛的BRDC 防控提供参考.

1 材料与方法

1.1 临床样本

2016 年10 月～2018 年6 月采自四川省5 个市11 个引种肉牛场的BRDC 样本共计108 份.样本采集的牛群为从外地引进的3 ～10 月龄的肉犊牛和架子牛，在引进后5 ～14 d 内表现出流鼻涕、咳嗽、呼吸困难、发烧等临床症状.样本详细信息见表1.

1.2 主要试剂

TrizolTMReagent、PrimescriptTM反 转 录 试 剂 盒、Premix taq 等购自TaKaRa 公司；Stool DNA Kit 核酸提取试剂盒购自OMEGA BIO -TEK 公司；TrackItTMUltra Low Range DNA Ladder 购自Thermo Fisher 公司.

1.3 检测10 种病原的PCR 方法

参考文献[13、16、18 -23]报道的的PCR 方法分别对IBRV、BVDV、BCV、BPIV3、BRSV、BAV3、M. Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni 进行检测，引物信息见表2.引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

表1 108 份BRDC 样本信息Table 1 Sample information of 108 BRDC

表2 10 种病原检测引物信息Table 2 The primers for detection of 10 pathogens

1.4 M.haemolytica 荚膜血清型1、2 和6 型鉴定方法

采用文献[24]报道的鉴定M.haemolytica 荚膜血清型1、2 和6 的多重PCR 方法对M.haemolytica 阳性样本进行鉴定. 荚膜血清型1 型扩增片段长度为306bp，位于Hyp 基因序列，引物上下游分别为1F：CATTTCCTTAGGTTCAGC， 1R： CAAGTCATCGTAATGCCT；荚膜血清型2 型扩增片段长度为160bp，位于Core2 基因序列，引物上下游分别为2F：GGCATATCCTAAAGCCGT，2R：AGAATCCACTATTGGGCACC；荚膜血清型6 型扩增片段长度为78bp，位于TupA 基因序列，引物上下游分别为6F：TGAGAATTTCGACAGCACT，6R：ACCTTGGCATATCGTACC.

1.5 核酸提取

将采集的108 份BRDC 样本，分别用5 mL PBS处理，剧烈混匀后，取上清液5 000 r/min 4 ℃离心10 min，分别取300 μL 于灭菌的1.5 mL EP 管中(每个样本两份).采用Trizol 法提取108 份BRDC 样本的RNA，并采用PrimescriptTM反转录试剂盒合成cDNA；同时采用Stool DNA Kit 核酸提取试剂盒提取108 份BRDC 样本的DNA.核酸于-20 ℃保存备用.

1.6 临床样本检测

采用文献[13、16、18 -23]报道的IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BRSV、BAV3、M. Bovis、P. multocida、M.haemolytica、H. somniPCR 检测方法对11 个牛场108份BRDC 样本进行检测.并采用文献[24]报道的鉴定M.haemolytica 荚膜血清型1、2 和6 的多重PCR 方法对M.haemolytica 阳性样本进行鉴定.

2 结果

2.1 108 份BRDC 样本10 种病原检测结果

对11 个牛场108 份BRDC 样本中10 种常见病原的检测结果显示，IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica 和H.somni 的平均阳性率分别为37%(40/108)、16.7%(18/108)、4.6%(5/108)、5.6%(6/108)、6.5%(7/108)、24.1%(26 /108)、6.5%(7/108)、46.3%(50/108)和5.6% (6/108)，BRSV 未检出；IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica 和H.somni 的场阳性率分别为8/11、3/11、2/11、2/11、4/11、5/11、2/11、8/11 和3/11，其中IBRV、M. Bovis和M. haemolytica 的场阳性率较高，且三者混合感染情况严重，见表3.

2.2 M.haemolytica 阳性样本1、2 和6 荚膜血清型鉴定结果

采用文献[24]报道的鉴定M. haemolytica1、2 和6 荚膜血清型的多重PCR 方法，对M. haemolytica 阳性样本分型鉴定结果显示，50 份M. haemolytica 阳性样本中30 份为荚膜血清型6 型(30/50)，8 份为血清荚膜型1 型(8/50)，3 份为荚膜血清型2 型(3/50)，9份阳性样本未确定型，见图1.

图1 部分M.haemolytica 荚膜血清型1、2 和6 型鉴定结果Fig.1 Partial identification results of the capsular serotypes1，2 and 6 of M. haemolytica

表3 108 份BRDC 样本病原阳性检出率Table 3 The positive rate of the 10 pathogens from 108 samples

3 讨论

随着我国肉牛养殖业的发展，肉牛养殖数目显著增多，而由于受市场供求关系和产业布局等因素的影响，我国肉牛长距离、大范围的调运也显著增多[9].在运输过程中，引种肉牛群受到多种应激因素的刺激，加之在病原微生物的作用下，导致牛群BRDC 的爆发[8].本实验对采自四川省11 个引种肉牛群的108份BRDC 样本中10 种常见的病原检测结果显示，9 种病原被检出，包括IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni，说明国内引种肉牛群感染病原种类复杂，但不同病原在不同牛场的检出率不同，如IBRV 在个别牛场的检出率很高(11/14)，也有牛场未检出；不同病原的场阳性率也不相同，证明不同地区感染的病原存在差异；IBRV、M.Bovis 和M. haemolytica 的场阳性率和个体阳性率均较高，说明IBRV、M.Bovis 和M.haemolytica 是导致引种肉牛群爆发BRDC 的常见原因.个别牛场病原混合感染严重，如采自四川省宜宾市的一牛场引种肉牛群中检测出9 种病原，且多种病原的检出率均较高(IBRV 10/13、BVDV 7/13、M.Bovis7/13、M.haemolytica11/13)，使得防控难度增加. 有必要进一步加强我国主要肉牛供应地的病原流行病学调查，包括健康带毒情况的调查，为引种肉牛BRDC 的防控提供参考.

BRDC 病因复杂，一般认为病毒是BRDC 爆发的主要原因，国外常见的病毒是IBRV、BVDV、BCoV、BRSV、BPIV3 等[2]. 国内已有较多关于IBRV 和BPIV3 的病原流行病学资料[15-16]，表明其是国内BRDC 的常见病原[10].本实验BVDV 和BCoV 的平均阳性率为16.7%和4.6%，但个别牛场中BVDV 和BCoV 的阳性率较高(分别为10/14 和3/14)；国内BVDV 和BCoV 与腹泻相关的病原流行病学调查已较多[18-19]，但其与BRDC 相关的报道不多. 国外BVDV和BCoV 是BRDC 的常见病原，BVDV 是致加拿大BRDC 重要病原之一，其阳性率高达69%[25]；BCoV是巴西爆发BRDC 的常见病原，其在巴西BRDC 牛群中阳性率可达22%[4].因此，有必要进一步加强对我国BVDV 和BCoV 在BRDC 中流行情况的调查.BAV3在美国的阳性率为48%[2]，国内已有分离BAV3 的报道[13]，但其流行情况还不清楚. 尽管在本实验中BAV3 的平均阳性率只有6.5%，但是在4 个牛场中均检出BAV3，且来自两个不同的省区. 结合国内BAV3 分离株情况[13]，表明该病原在我国可能广泛分布，有必要进一步开展其流行病学调查.

细菌和支原体在BRDC 中扮演着重要角色，病毒感染牛呼吸道后，造成牛呼吸道上皮细胞受损和牛的免疫系统受到抑制，从而细菌和支原体等病原体侵入牛下呼吸道，引起继发感染，加重BRDC 的爆发[1].国外M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica 和H.somni 等是导致BRDC 的重要病原菌，国内关于M.Bovis 和P.multocida 的流行病学资料已较多[9]，其是我国BRDC的重要致病病原，本研究中M.Bovis 和P.multocida 的平均阳性率分别为24.1%和6.5%.M.haemolytica 属于条件致病菌，通常寄生于上呼吸道，主要在鼻咽和扁桃体隐窝中.按照M.haemolytica 荚膜抗原的不同，可分为12 种荚膜血清型((1、2、5、6、7、8、9、12、13、14、16 和17)，不同血清型毒力差别较大.M.haemolytica 荚膜血清型1 和6 型是主要致BRDC 的主要荚膜血清型[24].本实验中M.haemolytica 的平均阳性率为46.3%(50/108)，场阳性率为8/11，并且荚膜血清型1 和6 型的比例高达38/50，表明该菌是目前国内致肉牛BRDC 的重要原因之一. 目前国内关于M. haemolytica 分离鉴定已较多[12]，但是关于其流行的主要荚膜血清型的报道较少[12]，加强对M.haemolytica 荚膜血清型的鉴定非常有必要.

H.somni 是国外引起BRDC 的重要病原菌，如该菌在巴西BRDC 牛中阳性率高达39%，是导致BRDC的重要致病病原之一[4]. H. somni 除了引起牛肺炎之外，还能帮助致BRDC 病毒如BRSV 逃避宿主防御[26]，并且还与血栓栓塞性脑膜脑炎、纤维性心包炎、多发性关节炎-浆膜炎、流产和生殖道感染等疾病有关[23]. 国内采用PCR -DGGE 技术从健康肉牛生殖道中检测到H. somni[27]，但还未见H. somni 与BRDC 相关的报道.本实验中H. somni 的检出率不高(5.6%)，但是被检出的6 份样本是来自3 个省区的引种肉牛群，表明该菌可能有较广泛的地域分布.

4 结论

本实验对四川省11 个外地引种牛场爆发BRDC的108 份临床样本进行10 种病原检测，结果表明包括IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni 等9 种病原均有检出，说明感染病原复杂，且不同地区感染病原的种类具有差异；IBRV、M. Bovis、M. haemolytica 1 型和6 型的个体阳性率和场阳性率均较高，表明其在BRDC 中的作用值得关注.