不对称双缩二氨基硫脲席夫碱荧光探针的合成及其性能研究

罗国力，赵志刚，石治川

(西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041)

锌是人体内含量第二多的元素，在人体内起着至关重要的作用，如基因表达、参与细胞凋亡、神经传递、金属酶调节、同时也是RNA 和DNA 聚合酶的组成部分、是人体内不可或缺的重要元素[1-4]. 近年由于含重金属污染物的排放，对环境危害越来越大，对人类健康也造成巨大威胁.人体内积累较高浓度的锌离子会引起阿尔茨海默症、帕金森病、糖尿病、免疫系统受损；缺少锌离子可能会引起腹泻、认知功能受损及大脑发育异常等现象等[5]. 因此，锌离子检测备受人们的关注.在众多检测方法中，荧光法由于操作简便，可实时监测受到人们的青睐. 基于不同荧光基团作为荧光传导信号检测锌离子已有大量报道[6-9]，但是部分探针分子仍然存在着合成线路较长、只能在纯溶剂中检测等缺点，限制了这些荧光探针的进一步应用.

硫脲席夫碱因其结构中独特的活性亚结构-CSNHN=CH -单元，其中的N、S 两个杂原子杂化轨道上的孤电子对，不仅使得物质自身能形成稳定的金属配合物而，且能较大提高生物环境的相容性[10].硫脲席夫碱结构中的S 原子还常以硫桥的形式配位，既能是氢键供体也可是受体，可以形成分子内或分子间氢键，构筑多维和各种拓扑结构的超分子化合物[11].因此，开发合成简单、经济实用的硫脲席夫碱荧光探针分子仍然具有重要的意义[12-13]. 本论文合成的硫脲双席夫碱化合物结构中含有两个共轭体系，相较于单个共轭体系分子更易于产生n -π∗和π -π∗的电子跃迁，进而发生某些光学性质的特效反应，在识别金属离子和作为荧光探针配体方面具有很好的研究价值.其合成路线见Scheme 1.

Scheme 1 探针L1 的合成路线Scheme 1 Synthesis route of probe L1

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

本实验所用试剂均为市售分析纯级. 对氯苯甲醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；

噻唑-5 -甲醛(百灵威科技有限公司)；金属盐为醋酸盐或硝酸盐(成都金山化学试剂有限公司)；实验用水为去离子水.

核磁共振仪： Agilent -400MHz， Me4Si 作内标，DMSO-d6作溶剂；质谱仪： FINNIGAN - LCQ DECA型； 红外光谱仪：傅里叶变换红外光谱仪PERKIN -ELMER1700 型，KBr 压片；元素分析仪： Vario MICRO自动分析仪；熔点仪： WRS -1B 型数字熔点仪；紫外-可见光分光光度计：Mapada UV -6100 双光束紫外-可见光分光光度计；荧光光谱仪： Dual -FL 型；超纯水机：沃特浦WP-UPT-10 型；pH 计：梅特勒-托利多FE28 型；微波反应器：北京祥鹄科技有限公司商用微波反应器XH-100A，100 -1000W.

1.2 探针L1 的合成及表征

1.2.1 1，3 -二氨基硫脲1 的合成

在150 mL 三颈瓶中加入80 mL 80%水合肼和3 mL 2 -氯乙醇，冰浴下逐渐滴加30 mL CS2，反应3 h后有黄色固体生成.加入3 g NaOH 后加热至80 ℃，搅拌反应8 h，冷却至室温后抽滤，用水重结晶得到无色针状晶体1.收率84%，M.p. 171 ～172 ℃(Lit.M.p. 170 ～172 ℃)[14].

1.2.2 单缩二氨基硫脲int.2 的微波合成

在150 mL 三颈瓶中依次加入1.06 g (0.01 mol)1，3 -二氨基硫脲1、60 mL 水， 室温搅拌2 min 后滴加几滴冰醋酸，然后搅拌下缓慢滴加50 mL 乙醇溶液(1.40 g，0.01 mol 对氯苯甲醛)， 微波辐射下回流搅拌反应5 ～7 min.冷却过滤， 无水乙醇重结晶， 得到淡黄色int.2.收率93%，M.p. 210 ～212 ℃(Lit. M.p. 210 ～211 ℃)[14].

1.2.3 探针L1 的合成及表征

在25 mL 圆底烧瓶依次加入5 mL 甲醇， 1 mmolint.2，0.95 mmol 噻唑-5 -甲醛和1 滴冰醋酸，冰浴下反应25 ～40 h， TLC 监测反应进程，反应结束后过滤出固体，粗产品用乙醇重结晶得到纯品L1.

黄色颗粒. Yield 83%. Mp 171 ～172 °C. IR(KBr，cm-1)：3273，3134，3069，1597，1533，1493，1229， 1145， 1082， 832.1H NMR (DMSO - d6， 400 MHz)： δ 12.04 (s，1H， NH)，11.74 (s，1H， NH)，9.19 (s，1H， Thiazole -H2)， 8.89 (s， 1H， Thiazole-H4)，8.27 (s， 1H， N =CH)， 8.13 (s， 1H， N =CH)， 7.90 (s， 2H， ArH)， 7.53 (d， J = 8.0 Hz，2H， ArH).13C NMR (DMSO - d6， 100 MHz)：δ 175.10， 156. 83， 146. 12， 142. 64， 142. 07，136.62，135.02，133.36，129.62，129.26. ESI-MS m/z (%)：324([M+1]+，100). Anal.Calcd for C12H10ClN5S2： C， 44.51； H， 3.11； N， 21.63. Found：C，44.52； H，3.10； N，21.60%.

1.3 溶液的配制

1.3.1 Tris-HCl 缓冲液

称取12.1411 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)， 用去离子水溶解并定容至1 000 mL (0.1 mol/L)；量取浓盐酸9.0 mL， 用去离子水定容至1 000 mL (0.1 mol/L). 二者定量混合Tris：HCl(v/v = 50/42)，用pH 计微调至7.4.

1.3.2 不同pH 的溶液的配制

称取4.0011 g NaOH， 用去离子水溶解并定容至100 mL (1 mol/L)； 取9.0 mL 浓盐酸， 加入去离子水定容至100 mL (1 mol/L). 通过分别滴加上述浓度的NaOH 和HCl 溶液， 将Ethanol/Tris(v/v = 1/1)溶液的pH 依次调为4，5， ……，10 的溶液.

1.3.3 探针L1 储备溶液

称取161.9 mg 探针L1， 用100 mL DMSO 溶解完全后，加入Ethanol/Tris(v/v = 1/1， pH 7.0)溶液定容至标线，摇匀，得到浓度为1 ×10-3mol/L 的探针L1 储备液.

1.3.4 各种金属离子储备液

以Zn2+溶液配制为例：称取21.9 mg 二水合醋酸锌用去离子水溶液定容至刻度线，得到浓度1 ×10-3mol/L 的Zn2+溶液.其他金属离子(Ag+，Al3+，Ba2+，Ca2+，Co2+， Cr3+， Cu2+， Fe3+， Hg2+， Mg2+， Mn2+，Ni2+，Pb2+)采用醋酸盐或硝酸盐配制成浓度为1 ×10-3mol/L 的去离子水溶液.

1.4 光谱性质的检测方法

荧光滴定实验： 在含有3 mL Ethanol/Tris(v/v =1/1， pH 7.0)溶液的5 mL 比色管中加入500 mL 探针L1 储备液(1 × 10-3mol/L)， 然 后依次加入500 mL各种金属离子储备液(1 ×10-3mol/L)， 最后再加入Ethanol/Tris (v/v= 1/1， pH 7.0)溶液定标，摇匀，待测.探针L1 的最佳激发波长为400 nm，最佳发射波长为493 nm.

2 结果与讨论

2.1 探针L1 对不同金属阳离子的选择性

在探针L1 分子中，亚胺N 原子易与Zn2+发生配位，导致分子刚性增强，从而引起L1 光谱性质的变化.在L1 浓度为100 mmol/L 的Ethanol/Tris (v/v =1/1， pH 7.0)溶液中，分别加入相同浓度(100 mmol/L) 的不同金属阳离子(Ag+，Al3+，Ba2+，Ca2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，Mg2+，Mn2+，Ni2+，Pb2+)， 然后分别检测各自的紫外-可见光性质(图1) 和荧光性质(图2).在紫外-可见光性质检测过程中，探针L1 本身在334 nm 处有一个较强的吸收峰，当加入不同金属阳离子后，其在此处的吸收峰都出现了不同程度的降低.特别当加入Zn2+后，该吸收峰除了显著降低外，还发生了明显的红移，这可能是因为探针L1 与Zn2+络合后使探针分子中C =N 异构化受阻，增加了分子的刚性和体系的共轭程度.

在荧光性质的检测过程当中(图2)， 探针L1 本身有很微弱的荧光，当加入Zn2+后， L1 在493 nm 处的荧光强度显著增强，而当加入其他金属离子时，L1的荧光强度并无明显变化.在紫外灯365 nm 照射下，探针L1 溶液本身几乎没有荧光，当加入Zn2+后，溶液发出亮绿色强荧光，而当加入其它离子时，溶液没有荧光产生.这说明，探针L1 可以与Zn2+结合，产生螯合型荧光增强，从而实现对Zn2+的专一识别检测.

图1 探针L1 与不同金属离子作用后的紫外-可见光光谱Fig.1 The UV-Vis of L1 before and after the addition of various metal ions

图2 探针L1 与不同金属离子作用后的荧光光谱Fig.2 The fluorescence of probe L1 before and after the addition of various metal ions

2.2 不同pH 对探针L1 及L1 -Zn2+体系荧光强度的影响

考察了探针L1 和L1 -Zn2+在不同pH 下的荧光光谱.由图3 可见，随着pH 的增大，探针L1 的荧光强度基本上没有变化，而L1 -Zn2+体系则显著增强.当pH ＜7 时，荧光强度急速增加； 当pH ＞7 以后，探针的荧光强度继续增加，然后逐渐降低. 这可能是由于席夫碱结构在强酸性条件下容易发生分解.而碱性过大时，体系当中的Zn2+会形成Zn(OH)2， 两者都会对探针L1 与Zn2+的结合产生较大影响.由图3 可知，探针L1 可有效识别Zn2+的pH 适用范围为5 ～9.为了便于检测，本实验中我们均选择用纯水在近中性条件下进行测试.

图3 不同pH 下探针L1 及L1 -Zn2+体系在493 nm 处的荧光强度Fig.3 Effect of pH on fluorescence intensity (at 493 nm） of L1 in the absence and presence of Zn2+

2.3 探针L1 对Zn2+的荧光滴定及检测限

在L1 浓度为100 μmol/L 的Ethanol/Tris (v/v=1/1， pH 7.0)溶液中，逐渐滴加Zn2+，测定不同Zn2+浓度下的荧光光谱(图4). 随着Zn2+浓度从20、40、60、80、100、120、140 mmol/L 依次增加，L1 在波长493 nm 处的荧光强度显著增强. 当Zn2+浓度增大到160、180 mmol/L 时，L1 的荧光强度略微有所降低.

图4 不同浓度Zn2+存在时L1 的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of L1 in the presence of different concentrations of Zn2+

将锌离子浓度与探针L1 在493 nm 处的荧光强度绘制工作曲线，结果表明在20 ～140 mmol/L 范围内成良好的线性关系(图5)， 其线性回归方程为I493=353.0573+5.6497C (R2=0.9925). 根据检测限的计算公式[15，16]，计算该方法的检测限为5.8×10-6mol/L.

图5 不同浓度Zn2+与L1 荧光强度的线性拟合Fig.5 Fluorescence intensities (at 493 nm） of L1 versus concentration ofZn2+

2.4 探针L1 识别Zn2+的抗干扰性

为探究L1 对Zn2+的识别是否会受到其他金属离子的影响，进行了离子抗干扰实验. 在L1 浓度为100 mmol/L 的Ethanol/Tris (v/v = 1/1， pH 7.0)溶液中，加入100 mmol/L 的Zn2+，同时分别加入相同浓度的其他金属离子，测试其荧光光谱.以493 nm 处荧光峰强度为基准，记录相关数据后作图(图6). 当加入Ag+和Fe3+时，荧光强度出现了略微的离子干扰，这可能是因为Ag+和Fe3+与探针L1 存在一定的结合能力，从而阻碍了Zn2+与L1 之间的络合，导致荧光强度有微弱的降低. 而当加入其他金属离子，其荧光强度与只加入Zn2+时相比并无明显变化，这表明探针L1 对Zn2+的识别具有良好的荧光响应和优异的抗干扰能力，L1 是一种具有潜在应用价值的Zn2+荧光增强型探针.

图6 共存离子对L1 -Zn2+体系荧光强度的影响Fig.6 Fluorescence intensities of L1 upon addition of Zn2+ in the presence of other metal ions

2.5 探针L1 与Zn2+络合比的探究

为了研究探针L1 的络合模型，我们保持探针L1与Zn2+的总浓度之和为1.0 ×10-5mol/L 不变，然后连续改变Zn2+的百分比含量，并测定其相应的荧光强度.通过Job’s plot 作图法(图7) 可知，最大摩尔分数对应数值为0.69，即探针L1 与Zn2+所形成的是1：2 络合物，推测其络合模式如图8 所示.

图7 探针L1 与Zn2+的络合比测定曲线Fig.7 Job’s plot of L1 andZn2+

图8 探针L1 与Zn2+的络合模型Fig. 8 The proposed binding mode of L1 - Zn2+ system

3 结论

利用单缩二氨基硫脲为母体，设计并合成了一种用于检测Zn2+的荧光增强型探针L1. 在体积分数为50%的乙醇-水溶液中于中性或弱碱性条件下，探针L1 能够特异性识别Zn2+，并表现出非常高的选择性.探针L1 与Zn2+结合的物质的量之比为1：2，并且具有较强的稳定性、良好的抗干扰性和反应活性，具有潜在的应用前景.